O'zbekiston respublikasi oliy va o'rta maxsus ta'lim vazirligi qarshi davlat universiteti qo'lyozma huquqida udk 577. 17 (021) xasanov shuxrat mirza o'G'LI

§2.2. Trichoderma harzianum zamburug' 55 va 22 shtammlarining alkaloidlari va terpenoidlarini ajratish
O'zR FA Botanika institutida tuproq tarkibidan ajratib tozalangan Trichoderma harzianum55 shtammini Chapek ozuqa muhitida 10 l hajmda olib, 20 kungacha kachalkada xona temperaturasida o'stirildi. Ikkilamchi metabolitlar miqdoriy analiz qilinganda 14 kunda o'sganida ikkilamchi metabolitlar miqdori ko'p ekanligi aniqlandi. Ikkilamchi metabolitlarni ajratish maqsadida Trichoderma harzianum55 shtammining biomassasi kul`tural suyuqlikdan fil`trlash orqali ajratib olindi va zamburug' kul`tural suyuqligi hamda biomassasi quyida keltirilgan usullar yordamida ekstraktsiya qilindi.
1-usul. Chapek ozuqa muhitida 14 kun davomida kachalkada o'stirilgan Trichoderma harzianum 55 shtammining biomassasi kul`tural suyuqlikdan ajratildi va liofilli vakuumli quritish uskunasida 15-200S da zamburug' biomassasi quritildi. Quritilgan va maydalangan 13,15 gr biomassa ustiga 50 ml metanol quyilib bir kun qoldirildi. Metanol biomassadan fil`trlanib ajratildi va bu jarayon uch marta takrorlandi. Ajratib olingan metanol vakuumli rotorli haydash uskuna bilan erituvchi ajratilib, ekstraktsion summa olindi. Ekstraktsion summa miqdori 5,31 gr ni tashkil qildi.
Kul`tural suyuqlik, ya'ni suvli qismini 0,1% natriy gidrokarbonat eritmasi bilan pH=7 muhitida keltirilib, xloroform bilan ekstraktsiya qilindi. Ekstraktsiya jarayonidan ajratib olingan xloroform vakuumli rotorli haydash uskuna yordamida erituvchidan ajratilib, 0,99 gr quritilgan ekstraktsion summa olindi. YUQX ma'lumotlariga ko'ra ikkala summa ham bir xil tarkibga ega ekanligi aniqlanib, metanolli va xloroformli ekstraktsion summalar birga qo'shilib 6,30 gr ekstraktsion summa olindi (2.1.-jadval).
2.1.-jadval
Trichoderma harzianum55 shtammining ikkilamchi metabolitlarining miqdoriy analiz natijalari
Shtammning o'sish vaqti (kun) Kul`tural suyuqlik hajmi
(ml) Ekstraktsion summa (gr) Quruq biomassa
(gr) Ekstraktsion summa
(gr) Jami ekstraktsion summa
(gr)
3 10 000 0,42 7,6 1,25 1,67
7 10 000 0,53 10,2 2,89 3,42
14 10 000 0,99 13,15 5,31 6,30
20 10 000 0,58 13,52 5,28 5,86

2-usul. 1) Chapek ozuqa muhitida 14 kun davomida kachalkada o'stirilgan Trichoderma

harzianum55 shtammining biomassasi kul`tural suyuqlikdan fil`tr yordamida ajratildi.
Fil`trlangan 23,2 gr biomassasini 50 ml efir solingan kolbaga joylashtirildi va qaytarma
sovutkich joylashtirilib, 40-450S da suv hammomida qizdirildi. Zamburug' biomassasini
ekstraktsiya qilish jarayoni uch marta takrorlandi va 3,70 gr ekstraktsion summa olindi. Qolgan
suvli qismi 0,1% natriy gidrokarbonat eritmasi bilan rN=7 muhitida keltirilib, xloroform
bilan ekstraktsiya qilindi va ekstrakt vakuumli rotorli haydash uskuna bilan erituvchisi
ajratilganda 0,93 gr ekstraktsion summa hosil bo'ldi. Ekstraktsion summaning umumiy og'irligi
63 gr ni tashkil etdi (2.2.-jadval).
2. 2.-jadval
Trichoderma harzianum55 shtammining ikkilamchi metabolitlarining miqdoriy analiz natijalari
Shtammning o'sish vaqti (kun) Kul`tural suyuqlik hajmi
(ml) Ekstraktsion summa (gr) Zamburug' biomassasi (gr) Ekstraktsion summa
(gr) Jami ekstraktsion summa
(gr)
3 10 000 0,28 10,23 1,58 1,86
7 10 000 0,48 15,82 2,12 2,6
14 10 000 0,93 23,2 3,70 4,63
20 10 000 0,52 23,5 2,32 2,84

Ekstraktsiya. Ekstraktsiya jarayonida suvli fazadan ajratib olingan mitsella quritilmasdan efir

bilan efirninng bug'lanish temperaturasigacha qizdirilgan holda ekstraktsiya qilindi. Kul`tural
suyuqlikni efir bilan ekstraktsiya qilib, olingan ikkala ekstrakt qo'shilgan holda quruq natriy
sulfat qo'shib suvsizlantiriladi. Suvsizlantirilgan ekstraktlardan erituvchisi bug'latilib,
ekstraktsion summa olinadi. Birinchi usulga qaraganda ikkinchi usulda ekstrakt toza holatda
ekanligi, ya'ni qo'shimchalardan tozalangan ikkilamchi metabolitlar mavjudligi xromatografik
usulda aniqlandi.
Ko'rsatilgan usullardan olingan ekstraktlar turli xil adsorbentlar va erituvchilar
aralashmalaridan foydalanilgan holda ustunli xromatografiya usuli yordamida ajratildi.
Natijada 6 ta individual moddalar ajralib chiqdi (2.1-chizma).
Ustunli xromatografik kolonkada joylashtirilgan ekstraktsion summa aralashtirilgan adsorbent
geksan elyuent bilan yuvildi. Geksanli fraktsiyadan molekulyar og'irligi M+ 538 bo'lgan
uglevodorod ajralib chiqdi. Geksan - efirli (1:1) elyuentdan foydalanganda M+ 440 og'irlikka
ega bo'lgan neytral modda YUQX (silufolda) fosfor – vol`fram kislota bilan sifat analiz
qilinganda qizil rangning hosil bo'lishi ergosterol (XII) ekanligini ko'rsatadi. Ustunli
xromatografiyani davom ettirib xloroform-metanol (70:1) elyuent aralashmasi bilan yuvish davom
ettirilganda indolsirka kislota (136) va staxibotral` (137)ajralib chiqdi.
Ikkilamchi metabolitlarni bir-biridan ajratib olish uchun xloroform-metanolli elyuent
aralashmasi (70: 1) yordamida rexromatografiya qo'llanildi, natijada sof holdagi indolsirka
kislota (136) ajratib olindi.
Staxibotral` (137) juda oz miqdorda bo'lgani sababli, u faqat 95% tozalik (indolsirka
kislotaning 5% aralashmasi) holda olindi.
Ustunli xromatografik kolonkani xloroform - metanol (20:1) elyuent aralashmasi bilan
elyuirlanganda gibberillin A (138) ikkilamchi metabolit ajratib olindi.
2.1-chizma
Elyuirlangan sistemani xloroform - metanol (10: 1) aralashmasi bilan o'zgartirilganda
gibberillin (135) ajratib olindi. Ustunli xromatografiya jarayonini davom ettirib, xloroform
- metanol (1:1) elyuent aralashmasi bilan yuvilganda 45 mg 13,24-dimetoksilgibberillin
ajratib olindi.
§2.4. Trichoderma harzianum 22 shtammining alkaloidlari va terpenoidlarini ajratish
O'zR FA Mikrobiologiya institutida o'simlik rezorferasidan ajratib tozalangan Trichoderma
harzianum 22 shtammlarining kul`tural xususiyatlari o'rganishda ularning Petri likobchalarida
koloniyalarini o'stirish jarayonida tadqiq etildi. Shtammlarning koloniyalarini o'stirish Chapek,
Mandel`s va susloli agar ozuqa muhitlarida 35, 45 va 550S haroratda 60–72 soat mobaynida
davom etdi.
Qattiq fazali o'stirish sterillangan, 60 % gacha namlikka ega bo'lgan bug'doy o'simtalarida olib
borildi. Sterilizatsiya 1 soat davomida 1 atm bosimda olib borildi. Ekish materiali sifatida
zamburug' shtammining konidiyali va mitseliyali suspenziyasidan foydalanildi. Titri
1•106spora/ml ga teng bo'lgan 50 ml suspenziya 500 g substrat uchun qo'llanildi. O'stirish 3–5
sutka davomida 300S haroratda olib borildi. Bug'doy o'simtalarida o'stirilgan zamburug'
biomassasi suv bilan 1:10 nisbatda suv bilan suyultirildi. Shu tarzda olingan biomassa
suspenziyasi 10l Mandel`s ozuqa muhitida 14 kun davomida kachalkada o'stirildi. O'stirilgan
biomassasi kul`tural suyuqlikdan ajratilganda 30,83 gr ni tashkil qildi. Fil`trlangan 30,83
gr zamburug' biomassasini 150 ml efir solingan 500 ml kolbaga joylashtirildi va kolbaning
og'ziga qaytarma sovitkich o'rnatilib 40-450S gacha suv hammomida qizdiriladi. Zamburug'
biomassasini ekstraktsiya qilish jarayoni uch marta takrorlandi va 3,6 gr ekstraktsion summa
olindi. Qolgan suvli qismiga xloroform bilan ekstraktsiya qilindi va ekstrakt vakuum rotorli
uskuna bilan quritilganda 0,93 gr ekstraktsion summa hosil bo'ldi. Ekstraktsion summaning
umumiy og'irligi 4,53 gr ni tashkil etdi (2.7-jadval).

2.7-jadval

Trichoderma harzianum 22 zamburug'ining ikkilamchi metabolitlarining miqdoriy analiz
natijalari
Mitsellani o'sish vaqti (kun) Kul`tural suyuqlik hajmi
(ml) Ekstraktsion summa (gr) Mitsella biomassasi (gr) Ekstraktsion summa
(gr) Ekstraktsion summa
(gr)
3 10 000 0,24 8,21 0,54 0,78
7 10 000 0,56 16,32 1,45 2,01
14 10 000 0,93 30,83 3,60 4,53
20 10 000 0,85 30,88 2,56 3,41
Trichoderma harzianum 22 zamburug'larining ikkilamchi metabolitlarini ustunli xromatografiya
yordamida identifikatsiyalaganda quyidagi (2.8-jadval) ikkilamchi metabolitlar ajratib olindi.
2.8-jadval
Trichoderma harzianum 55 va 22 zamburug' shtammlaridan olingan alkaloidlar va terpenoidlar
№ Ikkilamchi metabolitlar Rf Xromatografik sistemalar
1. Indolsirka kislota 0,60 4
2. Garzian kislota 0,62 3
3. Gibberillin A3 0,47 8
4. 5-[(2-metoksi-fenoksi)metil]-1,3-oksazolidin-2-on 0,48 9
5. 2,3-digidro-1,4-benzpiranol-4 0,69 1
Gibberellin A3 ni ajratish. Trichoderma harzianum harzianum shtammining 500 ml kul`tural
suyuqligini biomassadan ajratib RN = 3,5 ga tengligi aniqlandi. Eritmaning RN = 3,3 ga
kelguncha 0,5 M li HCl eritmasidan solindi. Eritmaga 5%li bariy xlorid eritmasida cho'kma
tushmay qolguncha 75ml solindi. Aralashma 30 daqiqa tindirishga qo'yildi va cho'kma Byuxner
voronkasida fil`tr qog'oz yordamida eritmadan ajratildi. Ajratib olingan cho'kmani
qo'shimchalardan ajratish maqsadida 2l vodoprovod suvi bilan yuvildi. Qolgan kristall modda 70
-800S da quritildi. Qolgan qoldiq 2,1 gr ni tashkil qildi. Byuxner voronkasidan o'tgan
eritmani ammiakning kontsentrlangan eritmasi bilan RN=4,4 ga keltirildi. Eritma ustiga 3 gr
FeCl3 kristalidan solib chayqatilganda yana oq cho'kma hosil bo'ldi. Hosil bo'lgan cho'kmani
Byuxner voronkasida ajratilib quritildi. Quritilgan kristall modda 2,6 gr ekanligi
aniqlandi. Ajratib olingan qo'ng'ir rangli texnik gibberellin 2,6 gr ni tashkil qildi [180; -
37-42b, 181; -s. 354-355. ].
Gibberellinni toza kristall holda olish. Texnik gibberellindan 2,6 gr olib, uning
ustiga erib ketgunicha 50 ml distillangan suv solindi va 70-800S gacha qizdiriladi.
Eritmaning RN = 2-2,2 ga kelguncha 0,5 M li HCl eritmasidan solindi va etilatsetat bilan
ekstraktsiya qilinadi. Ekstraktsiya jarayoni eritmadagi gibberellin miqdori 500-700 mg/l gacha
kamayguncha amalga oshiriladi. Olingan etilatsetat ekstrakti suvsizlantirish uchun kaltsiy
xlorid bilan quritiladi va keyin aktivlangan uglerod bilan tozalandi. Buning uchun
ekstraktga 1% A markali aktivlangan uglerod qo'shiladi, 20 daqiqa aralashtiriladi va ikki
qatlamli fil`tr qog'oz orqali Buxner voronkasida fil`trlanadi. Quritilgan hamda tozalangan
etilatsetat kontsentrati vakuum ostida 45 ° C da rotorli haydash uskunasida kristallar hosil
bo'lguncha bug'latildi. Olingan kristallar quruq etilatsetatda qayta kristallanib tozalandi.
Natijada 1,68 gr gibberellin kristallari olindi. Olingan kristallar YUQX asosida va yuqori
samarali gaz-suyuqlik xromatografiyasi orqali gibberellin A3 ekanligi aniqlandi.
Kul`tura suyuqliklaridagi GK lar miqdori ularning fosfor?molibden vol`framat kompleksi
bilan hosil qilgan mahsulotlarning fotokolorimetrik tahlili orqali aniqlandi [180; - 37-
42b, 181; -s. 354-355. 182; -r. 286,183; 28-31 b].
Indol sirka kislotani ajratish. Kul`tural suyuqliklar tarkibidagi ISK miqdori Gordon va
Weber (1953) taklif etgan usul yordamida aniqlandi. Ozuqa muhitlariga shtammlar ekilib, 35?
450S haroratda 14 kun mobaynida o'stirildi. O'stirilgan shtammlar fil`trlandi va namunalardan
2 ml dan supernatant olinib 8 ml Salkovski reagenti (50 ml 35% li HClO4 va 1 ml FeCl3ning
0,5 M li eritmalari aralashmasi) bilan aralashtirilib, 20?30 daqiqaga qoldirildi. ISKli
namunalar qizil-pushti rang hosil qildi. So'ngra FEK ? KFK?2 (Rossiya) fotokolorimetrida 530
nm to'lqin uzunligida yashil yorug'lik fil`tri orqali supernatantlarning optik zichligi
tekshirildi. Namunalardagi ISKning miqdori ISKning standart egri chizig'i asosida hisoblandi
[162; .-p. 32-43].
Kul`tural suyuqlikdan ekstraktsiyasi quyidagicha amalga oshiriladi. Dastlab shtammlar 250 ml
suyuq Chapek ozuqa muhitiga ekilib, tebranma inkubatorda 35?450C haroratda ikki hafta
davomida o'stiriladi. O'stirish yakunlangach, fil`trlanib, supernatant olinadi. 1 n HCl
yordamida olingan supernatantning rNi 2,5?3 tushirilib, etilatsetat bilan
(etilatsetat:supernatant 2:1 hajmiy nisbatda olinadi) ikki marta ekstraktsiya qilinadi.
Etilatsetatli fraktsiya rotorli quritkichda 400C da quritilib, ISK olinadi [184;.- 28-31 b].
ISK identifikatsiyasi yupqa qatlamli xromatografiya (YUQX) usuli yordamida amalga oshiriladi.
Buning uchun etilatsetatli fraktsiya Silikagel plastinkalariga (Silikagel Gf254, qalinligi
0,25 mm) tomiziladi. So'ngra etilatsetat:xloroform:chumoli kislota (55:35:10) yoki
benzol:butanol:sirka kislota (70:25:5) bilan ishlov beriladi. Standart ISK bilan bir xil Rf
qiymat supernatant tarkibida ISK mavjud ekanligini ko'rsatadi [185; 29?34-b].
Mikromitsetlar kul`tura suyuqliklaridan ajratilgan ISK va boshqa indol halqasi saqlovchi
birikmalarning gaz xromatografiya?mass spektroskopiyasi sharoitlari adabiyot manbasida
keltirilgandek tanlandi va olib borildi (Kamboj et al., 1999). CP Sil?5CB?MS (Chrompack,
London, UK) kapillyar kolonka (25 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 df) interfeys harorati 2750S
bo'lgan ion manbasiga ulandi va geliy gazi bosimi 40 kPa qilib belgilandi. Mass?
spektroskopiya manbasi harorati 2000S va elektron energiyasi 70 eV. Injektor harorati 2500S.
ISK va boshqa ekstraktlar yuborilgandan so'ng (1 mkl) GX o'chog'i 600S da 0.7 daqiqa davomida
ushlab turildi va taqsimlagich yopildi, so'ng o'choq harorati 0,3 daqiqadan so'ng bir daqiqa
davomida 270S dan 2000S ko'tarildi. Hosil bo'lgan ionlarning miqdoriy hisobi Lab?Base
(ThermoQuest, Manchester, UK) dasturi yordamida aniqlandi.
Garzian kislotasini ajratish. Chapek ozuqa muhitida 14 kun davomida kachalkada o'stirilgan T.
sharzianum shtammining biomassasi kul`tural suyuqlikdan fil`tr yordamida ajratildi. Fil`trlab
olingan 3 l kul`tural suyuqlikning pH=4 tenglashguncha 5M HCl kislota qo'shiladi va
etilatsetatda ekstraktsiya qilindi. Olingan ekstrakt Na2SO4 bilan suvsizlantirildi va
vakuumli rotorli haydash uskuna 35°C haydaldi. Erituvchisi ajratilganda 0,93 gr ekstraktsion
qizil summa hosil bo'ldi. Olingan quruq 0,93 gr ekstraktsion summasini 5 ml etilatsetatda
eritib 100 gr Silpearl silikageliga adsorbtsiyalandi. Adsorbent ustunli xromatografik
kolonkaga joylashtirildi. Ustunli xromatografik kolonka 10- sistema bilan yuvilganda 38 mg
2-gidroksi-2- [4- (1-gidroksiokta-2,4-dieniliden) -1-metil-3,5 – dioksopirrolidin – 2 –
ilmetil] -3 -metilomoy kislota ajratib olindi T suyuq.tem. 85-86°C; [?]D= +58,5 (CHCl3; s
1,0); [?]D= 15 + 19,6 (MeOH; s 1,06).
Olingan fraktsiya 4°S da etilatsetatda qayta kristallanib sariq kristall modda olindi [186;
.- 28-34 b, 187;- 19-25 b].
5-[(2-metoksifenoksi) metil]-1,3-oksazolidin-2-onni ajratish. Trichoderma harzianum
22shtammining quruq 32,8 gr ekstraktsion summasini 800 gr Silpearl silikageliga
adsorbtsiyalandi. Adsorbent ustunli xromatografik kolonkaga joylashtirildi. Ustunli
xromatografik kolonka 9-sistema bilan yuvilganda 23 mg 5-[(2-metoksifenoksi) metil]-1,3-
oksazolidin-2-on (VI) ajratib olindi. C11H13NO4, suyuq. tem. 157-159 °S (MeON da), Rf=0,6.
(YUQX, silufol, sist.3) [174; -p. 583, 175; -r. 139].
2,3-digidro-1,4-benzpiranol-4 ni ajratish. Trichoderma harzianum 22shtammining quruq 32,8 gr
ekstraktsion summasini 800 gr Silpearl silikageliga adsorbtsiyalandi. Adsorbent ustunli
xromatografik kolonkaga joylashtirildi. Ustunli xromatografik kolonka 10- sistema bilan
yuvilganda 18 mg 2,3-digidro-1,4-benzpiranol-4 (XI) ajratib olindi. Ajratib olingan modda
kristall xususiyatga egaligi aniqlandi. Olingan moddaning tuzilishi 1N YAMR spektroskopiya
usullari yordamida aniqlandi. S9N10O2, suyuq.tem. 148°S (metanol), Rf=0,56 (YUQX, silufol, 4
- sistema) [179;-r. 76].
Ergosterinni ajratish. Trichoderma harzianum 55 shtammining kam qutbli ikkilamchi
metabolitlarini o'rganish maqsadida zamburug' biomassasi kul`tural suyuqlikdan ajratildi va
quritilgan Trichoderma harzianum 55 shtammi biomassasini etanol bilan ekstraktsiya qilib
olindi. Ekstraktsion qoldiq geksan bilan ketma-ket yog'sizlantirib, ustunli xromatografiya
qilindi. Geksanda ajratilgan yog'li qismi ustunli xromatografik sistema bilan yuvish orqali
rexromatografiya qilindi. GLC/MS rexromatografik tahlil shuni ko'rsatdiki, ushbu 1-fraktsiyada
kamida to'qqizta komponentni o'z ichiga olgan moddalar borligi aniqlandi. Geksanli fraktsiya
xloroform bilan ekstraktsiya qilindi va xloroformli ekstrakt 2-fraktsiya olindi va 2-sistema
bilan ustunli xromatografiya qilinganda oq kristall modda ajratib olindi. 2-fraktsiyaning
tarkibi spektral ma'lumotlarga asoslanib ergosterol (XII) ekanligi aniqlandi [163; .-s.
134-135].

Ikkinchi bob bo'yicha xulosa

Trichoderma harzianum 55, Trichoderma harzianum 22 zamburug' shtammlari alkaloidlari va
terpenoidlari o'rganildi.
Alkaloidlar va terpenoidlarning miqdoriy tarkibi va sifat tarkibi zamburug' o'sadigan ozuqa
muhitiga, ularning tarkibidagi azot va uglerod manbaning miqdoriga va turiga, RN ning
qiymatiga va o'sish sharoitiga qarab turli miqdorda hosil bo'lishi aniqlandi.
O'rganiladigan qo'ziqorinlarning alkaloidlar va terpenoidlarining hosilalarini sintez qilish
orqali ularning fungitsitlik, gerbitsitlik va o'stiruvchanlik xususiyatlari oshganligi
ko'rsatildi.
Yuqoridagi xulosalardan kelib chiqib, zamburug'larning turli shtammlarini oziq-ovqat sanoati
chiqindilariga hamda turli xil o'simlik qoldiqlariga o'stirish orqali ekologik toza va
biologik faol preparatlar olish imkoniyatlari yaratiladi.?
III BOB. SESKVITERPENOID ALKALOIDLARI VA TERPENOIDLARNING TUZILISHI