Genomika asoslari

28-rasm. Edman uslubida oqsilning feniltiogidantoin N-uchini aniqlash
Hozirda Edman usuli genom ketma-ketligi noma’lum bo’lgan organizmlarni o’rganishda kamdan-kam qo’llaniladi. An’anaviy oqsillar ketma-ketligi, ularning ko’pgina xususiyatlarini masalan, translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalar, genlar ketma-ketligining tanib bo’lmaydigan qismlarini o’rganishda ishltiladi.
Aksariyat oqsillarni ketma-ketlikgini aniqlashdan oldin maxsus usulda tayyorlash kerak. Birinchidan, oqsil tarkibidagi disulfid bog’lanishlari, kislota bilan oksidlanish yoki, ditiotreytol bilan qaytarilish reaksiyasi natijasida yo’q qilinadi. Bundan tashqari, oqsil zanjiri maxsus proteazalar tomonidan bo’laklarga bo’linadi, chunki uzun oqsillarni ketma-ketligi past darajadagi aniqlikka ega. Odatda, gidroliz uchun tripsin fermenti ishlatiladi, ushbu ferment lizin yoki arginin qoldig’iga tegishli bo’lgan peptid bog’lanishlariga ta’sir qiladi. Shuning uchun, to’liq gidroliz paytida oqsil tarkibidagi lizin va arginin qoldiqlari soni tripsin orqali aniqlansa, hosil bo’lgan bo’laklar sonini taxmin qilish mumkin bo’ladi. Olingan bo’laklar elektroforez yoki xromatografiya usuli bilan qo’shimcha ravishda tozalanadi va Edmanga ko’ra ketma-ketlik hosil bo’ladi. Oqsil bo’laklarini ajratib ketma-ketliklarni olish uchun tripsin tomonidan aniqlanadigan qismlar va oqsilning boshqa qoldiqlarini taniy oladigan maxsus ferment bilan bo’laklarga bo’linadi. Olingan ikki hil bo’laklar umumiy oqsilning ketma-ketligiga asoslanib, oqsilning to’liq aminokislotalar ketma-ketligi tiklanadi.
Ikki o’lchamli gel elektroforez. 1970-80 yillarda oqsillarni ajratish va tozalash usullari rivojlandi. Ushbu usullar xromatografiya va elektroforez uslublarining prinsiplarini birlashtirdi, ularning ko’plari uzoq vaqtdan beri ishlatilmay qolgan, ammo ba’zilari hali 21-asrda ishlatilmoqda. 1970 yilda shveytsariyalik olim Ulrix Laemmli denaturatsiya asosida oqsillarni elektroforez bilan ajratish usulini taklif qildi. Birinchidan, oqsillar molekulyar massasiga ko’ra, qatlamlar shaklida natriy dodesil sulfating. Natriy dodesil sulfat, SDS ta’sirida denaturatsiyaga uchratilgan. Oqsil qancha ko’p bo’lsa, SDS shuncha ko’p bog’lanadi va ularning kompleksi shunchalik salbiy zaryadga ega bo’ladi. Shuning uchun, namunalar poliakrilamid gelida tekshirilganda, ular elektr maydon ta’sirida harakatlana boshlaydilar, oqsil molekulalarining harakatlanish tezligi ularning massasiga bog’liq, yengil oqsillar gel bo’ylab tezroq harakatlanadi. Ushbu uslubda molekulyar massasi 5 dan 250 kDa gacha bo’lgan oqsillarni ajratish uchun juda mos keladi. Laemmli usuli yanada rivojlantirildi, 1975 yilda Patrik O’Farell va Yoaxim Kloz mustaqil ravishda ikki o’lchamli elektroforez usulini taklif qilishdi. SDS yordamida ajratishdan oldin oqsillarni izoelektrik nuqtalariga ko’ra oldindan ajratiladi. Birinchidan, oqsillar statsionar pH ko’rsatkichiga ko’ra, maxsus polimerlar bilan to’ldirilgan shisha naychaga kiritiladi. Oqsillar naycha orqali taqsimlanadi, pH korsatkichga ko’ra, oqsillar izoelektrik nuqtasiga teng bo’lgan maydonlarga joylashadi. Keyinchalik, naychaning tarkibi ajratiladi va an’anaviy Laemmli boyicha gelda elektroforez o’tkaziladi. Shunday qilib, oqsillar avval izoelektrik nuqtaga, so’ngra molekulyar massasiga ko’ra bo’linadi. Ikki o’lchamli elektroforez usulida oqsillar an’anaviy elektroforezdagi kabi tasma bilan emas, balki oqsil kontsentratsiyasiga to’g’ri keladigan bo’yalish intensivligi orqali aniqlanadi. Ikki o’lchamli elektroforez yordamida nafaqat turli xil oqsillarni, balki bir xil oqsilning izoformalarini , shuningdek, translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalari har xil bo’lgan oqsil shakllarini ajratish mumkin. Ikki o’lchamli elektroforez texnikasini turli xil takomillashtirish taklif qilindi, uning ba’zi bosqichlari, shuningdek gell skanerlarni qayta ishlash tizimlari avtomatlashtirildi. Aslida, ikki o’lchamli elektroforez – bu proteomni tasavvur qilishning yagona usuli hisoblanadi.

A)Ikki o’lchamli elektroforez

B) SDS tomonidan oqsillarni denaturasiyasi

C) 2D elektroforez asosida oqsillarni bo’yash intensivligi