Введение. Цель, задачи предмета

Контрольные вопросы

1. 
   Роль нуклеиновых кислот в микробной клетке.
   
2. 
   Практическое значение препаратов нуклеиновых кислот и продуктов их гидролиза.
   
3. 
   Способы извлечения нуклеиновых кислот из микробной клетки.
   
4. 
   Роль аммиака и диаммонийфосфата в экстракции РНК из клеток дрожжей.
   
5. 
   Известно, что степень осаждения РНК в изоэлектрической точке растет с увеличением концентрации РНК в растворе. Какие способы Вы можете предложить для концентрирования полученного в данной работе экстракта?
   
6. 
   Какой растворитель (спирт или ацетон) целесообразнее использовать для сушки РНК и почему?
   
7. 
   Известен способ извлечения РНК из клеток дрожжей в виде белково-нуклеинового комплекса. Предложите состав экстрагента для этого случая.
   

Часть 2. Выделение “глобулиновой” фракции белка дрожжей

Ход работы
1. Подготовить установку к работе. Используется та же установка, что и в предыдущей лабораторной работе.
2. Подготовка денуклеинизированной биомассы (ДНБМ). ДНБМ, полученную в предыдущей работе, взвесить на технических весах, разбавить 10-кратным количеством дистиллированной воды. Суспензию перемешивать с помощью мешалки в течение 30 мин, после чего промывные воды отделить центрифугированием (6000 об/мин в течение 15 мин).
3. Взвесить ДНБМ после промывки и развести ее дистиллированной водой до содержания сухих веществ 10%, считая, что влажная ДНБМ после промывки содержит 70% влаги.
4. С помощью рН-метра установить значение рН суспензии на уровне 1,5÷1,7 добавлением серной кислоты.
5. Подготовленную суспензию поместить в реактор и провести экстракцию белковых веществ при 90^оС в течение 5 ч.
6. По истечении времени экстракции отключить подачу воды в рубашку реактора и обратный холодильник, отсоединить мешалку, термометр и холодильник, перелить содержимое реактора в коническую колбу или стакан и охладить до комнатной температуры.
7. Охлажденную суспензию разлить по 25 мл в центрифужные стаканы и отцентрифугировать при 6000 об/мин в течение 15 мин. Клеточные оболочки смыть большим количеством воды над раковиной, а бесклеточный белковый экстракт поместить на 30 мин в холодильник, предварительно измерив его объем.
8. Измерить концентрацию белковых веществ в экстракте методом Лоури (методика прилагается к работе). Пробу экстракта необходимо для анализа развести в 100 раз.
9. Провести осаждение “глобулиновой” фракции в ИЭТ. Для этого необходимо поместить в охлажденный экстракт электроды рН-метра и довести значение рН среды до 4,2÷4,7 раствором 10 н NaOH. Стакан с осадком белка поставить на 30÷40 мин в холодильник.
10. Осадок белка отделить от надосадочной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин.
11. Промыть осадок спиртом или ацетоном, добавив в каждый центрифужный стакан по 10 мл растворителя. Отработанный растворитель отделить центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин). Операцию повторить дважды.
12. Осадок белка высушить в центрифуге, включив ее на 20 мин при 1000 об/мин с открытой крышкой. Определить массу полученного осадка.
13. Измерить объем надосадка, полученного в п. 10, определить в нем концентрацию белка методом Лоури. Раствор необходимо развести для анализа в 50 раз.
В работе необходимо рассчитать:
а) степень экстракции белковых веществ:
Х_э = [P]э V_э/(m А/100),
где [P]_э – концентрация белка в экстракте, мг/л;
V_э – объем экстрагента, равный сумме объемов экстракта и воды, содержащейся в промытой пасте ДНБМ, л;
m – масса ДНБМ по сухому веществу, мг;
А – содержание белковых веществ в ДНБМ, % (задается преподавателем);
б) степень осаждения белка в ИЭТ:
Х_иэт = ([P]_э∙V₁-[P]_н/о∙V₂)/[P]_э∙V₁,
где V₁ – объем экстракта, л;
V₂ – объем надосадочной жидкости, л;
[НК]_н/о – концентрация белка в надосадке, мг/л;
в) оценить выход препарата:
У = m_п/M ,
где m_п – масса препарата “глобулиновой” фракции, мг.