Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева


Хақиқий вақт режимида полимераза занжирли реакциясини ўтказиш



Download 11,61 Mb.
bet59/89
Sana24.02.2022
Hajmi11,61 Mb.
#187443
1   ...   55   56   57   58   59   60   61   62   ...   89
Bog'liq
alimhojaeva uchebnik genetika uzb

2. Хақиқий вақт режимида полимераза занжирли реакциясини ўтказиш (Real-Time PCR)
Усулнинг асосланиши. Усул маълум бир тўлқин узунлигида ёруғлик энергиясини ютиши натижасида флуоресценция хусусиятига эга ва уни бошқа тўлқин узунлигида нурлантиришга қодир бўлган молекулалар - флуорофорларни қўллашга асосланган. Реакцион аралашмага ДНК-зондлар қўшилади, уларни таркибига 5`-ҳолатда флуоресцент ва 3`-ҳолатга флуоресценцияни сўндирувчи белги, хамда 3`-ҳолатда фосфат кислота киради. Бу зондлар амплификацияланувчи соха ичида ўрнашган бўлади. Сўндирувчи флуоресцент белгидан тарқалаётган нурланишни ютади, 3`-ҳолатдаги фосфат гурухи эса ДНК-полимеразани блоклайди. ПЗР жараёнида праймерларни юмшатиш босқичида ДНКнинг комплементар занжирига ДНК-зондларни бирикиши юз беради, бунда ПЗР боришида амплификация маҳсулотлари қанчалик кўп миқдорда бўлса, шунчалик мос келувчи ампликонлар билан зонд молекуласи кўп бирикади. Элонгация босқичида полимераза ДНКнинг комплементар занжирини синтезлайди ва зонд даражасига етиб борганда 5`-экзонуклеаз фаолликка эгалиги сабабли уни парчалашни бошлайди. Шундай қилиб, флуоресцент белги ва сўндирувчини ажралиши юз беради, бу эса детектирланган нурланишни ортишига олиб келади. Хақиқий вақт мобайнида ПЗР боришида қанчалик кўп ампликонлар синтезланса, нурланиш шунчалик интенсив бўлади.
Иш тартиби. ДНК амплификацияси усули Taqman зондларини қўллаш билан амалга оширилади.
1. ПЗР ўтказиш учун барча зарур реагентлар тайёрланади.
2. Стерил пробиркада компонентлар қўйидаги нисбатда аралаштирилади (1-жадвалга қаранг).
1 жадвал
ПЗР ўтказиш учун компонентларни аралаштириш схемаси

Компонент



Охирги концентрация

50 мкл аралашма-даги компонент миқдори

10х ПЦР-буфер



5 мкл

10мМ смесь дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат)

0,2 мМ хар бирига

1 мкл

Праймер 1 (5 мкМ)

0,1 мкМ

1мкл

Праймер 2 (5 мкМ)

0,1 мкМ

1мкл

TaqMan

0,25 мкМ

1 мкл

Taq-ДНК-полимераза

1,25 ед.

0,5 мкл

25мМ MgCI2

3,5 мМ

7 мкл

ДНК-матрица



0,1–1 мкг

наъмуна концентрациясига боғлиқ

Деионлашган сув



50 мкл гача

3. Вортексда аралаштирилади. Наъмуналар ДНК-амплификаторга жойлаштирилади ва дастур ишга туширилади:

  • ДНКни бирламчи денатурацияси 95оС да 10 дақиқа.

  • Цикл денатурацияси 95оС да 15 с.

  • Занжир элангацияси билан праймерларни юмшатиш 60оС да 1 дақ.

  • Флюоресцент сигнал детекцияси.

  • Амплификация циклини 40-45 марта қайтариш (2-4 босқичлар).

  • ПЗР реакция типини ўтказиш учун специфик полимеразалар ишлатилади (Pfu, Pwo ва бошқ.), уларнинг фаоллиги 60–72оС харорат чегарасида намоён бўлади.

  • Реакциядан сўнг эриш эгри чизиғини тузиш шарт эмас (бу ПЗР-маҳсулотлар эриши эгри чизиғи эмас, балки ампликон билан зонд дуплексидир).


Download 11,61 Mb.

Do'stlaringiz bilan baham:
1   ...   55   56   57   58   59   60   61   62   ...   89




Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©hozir.org 2024
ma'muriyatiga murojaat qiling

kiriting | ro'yxatdan o'tish
    Bosh sahifa
юртда тантана
Боғда битган
Бугун юртда
Эшитганлар жилманглар
Эшитмадим деманглар
битган бодомлар
Yangiariq tumani
qitish marakazi
Raqamli texnologiyalar
ilishida muhokamadan
tasdiqqa tavsiya
tavsiya etilgan
iqtisodiyot kafedrasi
steiermarkischen landesregierung
asarlaringizni yuboring
o'zingizning asarlaringizni
Iltimos faqat
faqat o'zingizning
steierm rkischen
landesregierung fachabteilung
rkischen landesregierung
hamshira loyihasi
loyihasi mavsum
faolyatining oqibatlari
asosiy adabiyotlar
fakulteti ahborot
ahborot havfsizligi
havfsizligi kafedrasi
fanidan bo’yicha
fakulteti iqtisodiyot
boshqaruv fakulteti
chiqarishda boshqaruv
ishlab chiqarishda
iqtisodiyot fakultet
multiservis tarmoqlari
fanidan asosiy
Uzbek fanidan
mavzulari potok
asosidagi multiservis
'aliyyil a'ziym
billahil 'aliyyil
illaa billahil
quvvata illaa
falah' deganida
Kompyuter savodxonligi
bo’yicha mustaqil
'alal falah'
Hayya 'alal
'alas soloh
Hayya 'alas
mavsum boyicha


yuklab olish