Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

Иш тартиби.
Аниқ бир ўлчамдаги графиклар усули
Бу C(T) – log P0 координаталарида экспериментал наъмуналарда субстрат концентрациясини (P0) топиладиган ДНК-стандарт суюлтиришлари серияси билан аниқ бир ўлчамдаги график тузиш усулидир.
Усулнинг аниқлиги стандарт серияларда ПЗР шароитлари (аввало амплификация самараси) қанчалик экспериментал наъмуналар ПЗР шароитларига яқинлигига боғлиқ. Шунинг учун стандартларни танлашда қўйидаги қоидаларга таяниш зарур:

• 
  Стандарт препаратда аралашмалар миқдори экспериментал препаратдагидай бўлиши;
  
• 
  Стандарт ДНК билан амплификацияланувчи фрагмент улуши экспериментал ДНК дагига яқин бўлиши;
  
• 
  Стандарт ДНК суюлтиришлар серияси экспериментал ДНКдаги субстрат концентрацияларини қамраб олиши керак.
  

Агар фақат субстрат нисбий концентрацияси аниқланса, аниқ ўлчамли график чизиш учун экспериментал наъмуналардаги суюлтиришлар сериясидан бирини қўллаш қулай. Аралашмалари ва реакцион аралашмадаги амплификацияланувчи фрагмент улуши бўйича наъмуналар бир-биридан жуда фарқ қилса, унда тажрибада уларнинг хар биридан суюлтиришлар сериясини тайёрлаш ва самарадорлиги таққослаш мақсадга мувофиқдир.
Натижаларни тўғридан-тўғри баҳолаш
C(T) = – (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E (1)

6-расм. Бевосита таққослаш усули бўйича ПЗР-РВ маълумотларини хисоблаш.

Тенгламадан маълумки, 1 ва 2 наъмуналардаги Е реакция самарасида, субстратнинг нисбий концентрацияси:

R = P1/P2 = E ^{– (C(T)}1^–C(T)2⁾ = E ^{- ΔС(T)} (2)
REF назорат кетма-кетлиги (масалан, housekeeping gene (конститутив, референс ген)) билан амплификация маълумотларини меъёрлаштиришни бажарамиз. Хар икки наъмунада REF реакцияси Eref самарадорлик билан кечса, унда:
R = E^{- ΔС(T)}/ Eref ^{- ΔС(T)}ref (3)
Агар “назорат” ва “синама” реакциялар ўхшаш бўлса, қуйидагича ифодаланади:
R = E^{- ΔС(T)}/ Eref ^{- ΔС(T)} ref = E ^ΔС(T)ref ^ΔС(T) (4)
Ва, ниҳоят, агар хар икки реакция (2) яқин самарада кечса, формула соддалашади:
R= E ^ΔС(T)ref ^-ΔС(T) ~ 2 ^ΔС(T)ref^-ΔС(T) = 2^-ΔΔС(T) (5)
ПЦР-РВ ўтказишда REF сифатида референс генга мос келувчи кетма-кетликни қўллаш мумкин, бироқ шуни эътиборга олиш жоизки, баъзи референс генлар турли тўқималарда сезиларли тарзда ўзгарган бўлади. Яхшиси бир неча house-keeping genes амплификациясининг ўртача катталиклари бўйича меъёрлаштиришни ўтказиш қулайдир.