Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

Иш тартиби
1. Антикоагулянтли (1:20 нисбатда ЭДТА нинг 6% эритмаси) қон мавжуд пробирка лейкоцитар массани олиш учун антикоагулянт ва қонни аралаштириш учун аста-секин чайқатилади, хона хароратида 3000 айл/дақ. тезликда 5 дақиқа центрифугаланади. Плазма (юқори фаза) индивидуал учлик билан олиб ташланади. Олинган қоннинг хужайра массаси (пастки фаза) эритроцитлардан тозаланади. Эритроцитларни ювиш услуби: 300 мкл ҳужайра массасига 1 мл буфер (10мМ трис-HCl, 5мМ MgCl2,10мМ NaCl) қўшилади ва 20 дақиқага эритроцитлар тўлиқ гемолизигача хона хароратига қўйилади. Сўнг 3000 айл/дақ.тезликда 5 дақиқа центрифугаланади.
2. Йиғма таркибига кирувчи лизисга учратувчи эритма ва 1 ювиш учун мўлжалланган эритма (агар улар 2-8°С хароратда сақланган бўлса) кристаллар тўлиқ эригунча 65°С хароратда қиздирилади.
3. Керакли миқдорда бир марта ишлатилувчи пробиркалар танлаб олинади (салбий ва ижобий натижалар бирга). Хар бир пробиркага 300 мкл лизисга учратувчи эритма қўшилади. Пробиркалар белгиланади.
4. Лизисга учратувчи эритмали пробиркага индивидуал аэрозол барьерли учлик билан 100 мкл наъмуна солинади. Салбий назорат (СН) пробиркасига эса 100 мкл ОКО қўшилади (салбий назорат наъмуна).
5. Наъмуналарни вортекстда аралаштирилади ва 65°С хароратда 5 дақиқа қиздирилади (агар Сиз қон зардоби билан ишласангиз наъмунани қиздириш керакмас). 5000 айл/дақ.тезликда 5 с микроцентрифугада айлантирилади. Агар наъмуна тўлиқ эримаса, микроцентрифугада пробирка 12 000 айл/дақ.тезликда 12 дақиқа айлантирилади ва ДНК ни ажратиш учун чўкма усти суюқлиги бошқа пробиркага олинади.
6. Вортекстда универсал сорбент диққат билан ресуспендирланади (йиғма таркибида бор). Хар бир пробиркага алоҳида учлик билан 25 мкл ресуспендирланган универсал сорбент қўшилади. Вортекстда аралаштирилади, шатативга 2 дақиқага қолдирилади ва яна аралаштириб 5 дақиқага штативда қолдирилади.
7. Пробиркадаги универсал сорбентни 30 сония давомида 5000 айл/дақ тезликда центрифугалаш билан чўктирилади. Чўкма усти суюқлигини вакуумли сўрғич ёрдамида алохида-алохида учликлар ёрдамида олиб ташланади.
8. Наъмуналарга 300 мкл 1-чи ювиш учун эритма қўшилади (йиғма таркибида мавжуд), вортексда универсал сорбент тўлиқ ресуспедирлангунча аралаштирилади. Универсал сорбентни чўктириш учун микроцентрифугада 5000 айл/дақ.тезликда 30 сония айлантирилади. Чўкма усти суюқлигини вакуумли сўрғич ёрдамида алохида-алохида учликлар ёрдамида олиб ташланади.
9. Наъмуналарга 500 мкл 2-чи ювиш учун эритма қўшилади (йиғма таркибида мавжуд), вортексда универсал сорбент тўлиқ ресуспедирлангунча аралаштирилади. универсал сорбентни чўктириш учун микроцентрифугада 10000 айл/дақ.тезликда 30 сония айлантирилади. Чўкма усти суюқлигини вакуумли сўрғич ёрдамида алохида-алохида учликлар ёрдамида олиб ташланади.
10. 8-чи пунктга асосланган ҳолда ювиш жараёни қайтарилади, чўкма усти суюқлиги тўлиқ олиб ташланади.
11. Универсал сорбентни қуритиш учун пробиркалар 65°С хароратга термостатга 5-10 дақиқага жойлаштирилади. Бунда пробиркалар қопқоғи очиқ бўлиши керак.
12. ДНК элюцияси учун пробиркаларга 50 мкл ТЕ-буфер қўшилади (йиғма таркибида бор). Вортексда аралаштирилади. термостатга 65°С харо-ратга 5 дақиқа қўйилади, доимий равишда вортексда аралаштириб турилади.
13. Пробиркалар микроцентрифугада 12000 айл/дақ.тезликда 1 дақиқа айлантирилади. Чўкма усти суюқлиги тозаланган ДНК тутади. Наъмуналар ПЗР ўтказишга тайёр хисобланади.
Тозаланган ДНК ни 2-8 °С хароратда 1 хафта, -16°С дан юқори хароратда 1 йил мобайнида сақлаш мумкин.
ДНКни ажратиш самарадорлиги 50-70%ни ташкил қилади.