3-расм. Хақиқий вақт режимида ПЗР принципи. Ампликонлар тўпланиш детекцияси праймерлар ўртасидаги нишон соха билан гибридизацияланувчи олигонуклеотид зонд ёрдамида амалга ошади. Зонд ўзида флуорофор (F) ва унинг ёнгинасида жойлашган блокловчи флуоресцент сўндирувчи (Q) тутади. Комплементар занжир синтези давомида полимераза зондни парчалайди, натижада флуоресценция ходисаси юз беради.
Амплификацияни қайд этишнинг кўплаб усуллари ишлаб чиқилган. Диагностик ПЗР-йиғмаларда кўпинча TaqManTM ёки молекуляр маёқчалар типидаги (molecular beacons) флуороген зондларга комплиментар ампликонлар ишлатилади, уларнинг флуоресценция интенсивлиги ампликон тўпланишига пропорционал ўзгаради (3-расм) ва махсус асбоблар – оптик модулли амплификаторларда хақиқий вақт давомида қайд қилинади.
Ҳозирги кунда ПЗР-тахлили клиник амалиётда вирусли инфекцияларни (ВИЧ, гепатит, жинсий инфекциялар) ташхислашда, оталикни аниқлашда, ирсий касалликларни ташхислашда (мутациялар мавжудлигини), суд тиббиётида (шахсни идентификациялашда) қўлланилади. Фундаментал илмий амалиётда эса ушбу усул секвенирлаш (нуклеотид кетма-кетликни аниқлаш), генларни клонлашда, ген инженериясида (трансген ҳайвон ва ўсимликларни яратиш), мутагенезга қаратилган ген терапияда қўлланилади.
4-расм. Полиакриламид гелда электрофорез учун камера. ДНК наъмуналари гелдаги махсус чуқурчаларга солинади. Камера тузли буфер эритма билан тўлдирилади, ундан электр токи ўтказилади. Ультрабинафша нурларда терли узунликдаги ДНК фрагментларига мос келувчи йўл-йўл чизиқлар кўринади.
ДНК фрагментларини электрофорези. Электрофорез тажриба натижаларини (ПЗР ва бошқалар) визуализацияси учун қўлланилади. ДНК фрагментларини электрофорези уларни ажратиш ва агарозали ёки полиакриламидли гелда тарқалишини таъминлайди (4-расм). ДНК фрагментлари уларнинг катталигига қараб электр майдонида харакатланади. Фрагментни молекуляр массаси қанчалик катта бўлса, электр майдонида шунча секинроқ характланади. Электрофорез тугагач, ДНК нинг хар бир фрагменти гелда йўл-йўл чизиқ кўринишида намоён бўлади. Хар бир фрагмент узунлигини аниқ катталикдаги ДНК наъмунаси (маркер) босиб ўтган масофа билан солиштириб аниқланади. Натижаларни визуализацияси учун гел бўялади. Кўпинча гел этидий бромид бўёғи қўлланилади, унда бўёқ ДНК билан боғланади. ДНК фрагментларига мос келувчи чизиқлар гелни ультрабинафша нур билан нурлантирилганда (нур спектрининг қизил сохаси) аниқланади.
Электрофорез ёрдамида фрагментларни кетма-кет ажратиш билан ПЗРни қўллашда текширилувчи генда делеция ва қўшимчаларни аниқлашга имкон беради.
5-расм. Алькогольдегидрогеназа гени фрагментини рестрикцион тахлили (ADH)
ПЗРдан кейин делеция ҳолати юз берса меъёрий генга нисбатан кичикроқ узунликдаги фрагментлар ҳосил бўлади, қўшимча киритилганда эса (дупликация) – узунлашади. Асосларни алмаштириш фрагментларни узунлигига таъсир этмайди, шунинг учун уларни аниқлаш учун ретрикцион фрагментларни узунлигини полиморфизми ва секвенирлаш усулини қўллаш мумкин.
Ретрикцион фрагментларни узунлигини полиморфизми ва секвенирлаш усули. Нуклеотидлар сонини сезиларли равишда алмаштириш ДНК кетма-кетлигида терли рестриктазалар учун янги сайтлар пайдо бўлишига олиб келади. Натижада меъёрий ДНК фрагменти ва нуклеотид алмашган фрагмент бир рестриктаза билан кесилади ва узунлиги бўйича фарқ қилувчи турли сондаги фрагментлар ҳосил бўлади. Турли узунликдаги фрагментларни электрофорез усули билан осон аниқлаш мумкин.
Бунга алькогольдегидрогеназа гени фрагментини рестрикцион тахлили мисол бўла олади (5-расм). ПЗРдан кейин 165 н.ж. (нуклеотид жуфтлиги) тенг фрагмент ҳосил бўлади. ADH-1 аллели алмаштиришга учрамайди, МаеIII рестриктазаси билан ишлов берилгач электрофорезда 2 та фрагмент (98 ва 68 н.ж.) аниқланади. ADH-2 аллели нуклеотид алмашинувига учраган (алмашинишда рестриктаза учун ортиқча сайт пайдо бўлади) ва рестриктазадан кейин 3 та фрагмент (63,36 ва 68 н.ж) ҳосил бўлади.
ДНК секвенирлаш. Секвенирлаш – ДНК нуклеотид кетма-кетлигини аниқлашдир. Бу усул инсон геномини меъёрда ва патологияларда ўрганиш учун ишлатилади. Секвенирлаш ёрдамида генларнинг аллел вариантлари, ҳамда ген мутацияларининг хар хил турлари (кўпинча асосларни алмашиш бўйича) аниқланади. «Инсон геноми» дастури натижасида инсон геномининг нуклеотид кетма-кетлигини ДНКни секвенирлаш усулларини қўллаш ёрдамида аниқлаш ётади (дастурнинг асосий қисми 2003 йилда тугалланган).
ДНКни секвенирлашнинг бир неча усуллари маълум. Улардан биринчиси Максам-Гилберт кимёвий усули, сўнг Сенгернинг ферментатив усули таклиф этилган. Хозирги кунда асосан ДНКни дидезоксинуклеотид усулида секвенирлаш қўлланилмоқда.
Бу муолажада ДНКнинг битта занжирининг кетма-кетлиги аниқланади ва у специфик нуклеотидлар занжирини узайтиришда ҳосил бўлган комплементар занжир сериялари синтези учун матрица бўлиб хизмат қилади. Синтезни тўхтатиш учун дидезоксинуклеотид – 2' ва 3'- гидроксил гурухларидан махрум бўлган сунъий синтезланган нуклеотидлар қўлланилади ва шунинг учун улар кейинги нуклеотид занжирига бирика олмайди. ДНК наъмунаси 4 та пробиркага ажратилади, уларга праймер, ДНК-полимераза, 4 та нуклеотид уч фосфатлар аралашмаси (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) ва кам миқдорда дидезоксинуклеотидлардан бири (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ) қўшилади. Синтез вақтида ДНК-полимераза занжирга тасодифий тарзда нуклеотид ва дидезоксинуклеотидни қўшади. Бунда хар бир пробиркада турли узунликдаги, дидезоксинуклеотидлар бири билан якунланувчи фрагментлар пайдо бўлади.
Бундан кейин электрофорез ўтказилади, бу эса ДНК фаргментининг фарқланувчи битта нуклеотидини ажратишга имкон яратади. Натижада гелда зинапояни эслатувчи чизиқлар йиғмаси ҳосил бўлади. Гелда ДНК нуклеотид кетма-кетлиги пастдан юқорига ДНК занжирининг 5'-3' йўналишига мос ҳолда ўқилади. ДНКнинг катта фрагментларини нуклеотид кетма-кетлигини аниқлаш учун автоматик ускуналар (ДНК-секвенаторлар) ишлатилади.
