Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Фоточувствительные направляющие олигорибонуклеотиды для контро-
лируемого редактирования генома 
Новопашина Д.С.
1,2
, Хабардина Е.А.
2
, Вохтанцев И.П.
2
, Ким Д.В.
1
, Жарков Д.О.
1,2
, 
Веньяминова А.Г.
1
1
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия 
2
Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
Технологии редактирования ДНК с помощью системы CRISPR/Cas9 открывают 
новые возможности использования этой системы в терапевтических целях. Актуальным 
в этом плане является создание новых подходов к лечению заболеваний, вызванных 
увеличением копий определенных генов, например, синдром Шарко-Мари-Тута 
(наследственная нейродегенеративная патология, причиной которой может служить 
лишняя копия гена периферического белка миелина PMP22) и синдром Дауна. Исполь-
зование CRISPR/Cas9 системы для контролируемого уменьшения числа копий мульти-
плицированных генов является оригинальным подходом к лечению этих генетических 
заболеваний.
Одним из вариантов контроля за активностью олигонуклеотидных конструкций
в клетках является использование фотоактивируемых структур в их составе. Основной 
идеей данной работы является введение в структуру направляющих РНК (sgРНК или 
crРНК/tracrРНК), входящих в состав системы CRISPR/Cas9, модификаций, позво-
ляющих в определенный момент инактивировать эту РНК и прекратить действие 
системы редактирования генома.
Целью данной работы являлась разработка подхода к созданию модифициро-
ванных синтетических направляющих РНК, содержащих фоторасщепляемый линкер, 
которые можно будет использовать для контролируемого редактирования генов в сос- 
таве CRISPR/Cas9 системы. В качестве фоторасщепляемых линкеров нами были исполь-
зованы остатки 1-орто-нитрофенилэтиленгликоля. 
Были получены аналоги sgРНК, crРНК и tracrРНК, содержащие одну или несколько 
фоторасщепляемых вставок в участках, комплементарных модельной ДНК-мишени, 
и/или в участках взаимодействия с белком Cas9. Исследована кинетика расщепления 
фоточувствительных направляющих РНК в растворе при УФ-облучении, подобраны 
оптимальные условия. В результате сравнительного исследования расщепления плаз- 
мидной ДНК системой CRISPR/Cas9 с использованием фоторасщепляемых направ-
ляющих РНК до и после УФ-облучения, продемонстрирована возможность контроли-
руемого выключения этой системы. 
Возможность получения протяженных функциональных РНК, в том числе и нап- 
равляющих РНК, путем химического синтеза открывает путь к введению разнооб-
разных модификаций в состав таких РНК. Введение фотоактивируемых вставок в ходе 
автоматического фосфитамидного синтеза по оптимизированному нами протоколу 
позволяет получать фоторасщепляемые направляющие РНК, облучение которых 
приводит к контролируемому выключению системы CRISPR/Cas9. 
Полученные в работе результаты подтверждают перспективность предложенной 
стратегии рационального дизайна фотоконтролируемых систем редактирования генома. 
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №19-04-00838.

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
47