|
2.2.1. Папаин
Папаин (лат.Papain) — полипептид, протеолитический растительный фермент, катализирующий гидролиз белков, пептидов, амидов и сложные эфиры основных аминокислот. В значительных количествах содержится в дынном дереве — папайе (Carica papaya).
Папаин является одним из протеолитических ферментов, присутствующих в латексе дынного дерева (Carica papaya L.). Название "папаин" было впервые предложено в конце 19-го века А.Вюрцем и Е.Бошутом и используется до настоящего времени для обозначения препаратов латекса.
Фермент содержится во всех частях растения за исключением корней. Неочищенный или частично очищенный папаин в прошлом был объектом многочисленных исследований. Однако, позднее было установлено, что сухой латекс дынного дерева, кроме папаина, содержит целый набор цистеиновых протеиназ, которые разделяются на три главные группы' собственно папаин, химопапаины А и В (КФ 3.4.22.6) и пептидазы А и В (КФ 3.4.22.6). В последние годы папаин и химопапаины были обнаружены также в латексе из вегетативных органов (листьев и черешков) дынного дерева. В 1937 г. Болз и др. впервые получили кристаллический папаин, а в 1941 г. .Янсен и Болз - кристаллический химопапаин.
Три главные группы ферментов латекса папайи различаются по физико-химическим свойствам. Так, они характеризуются разными значениями изоэлектрических точек, которые находятся в зоне рН 9,5, 10,1-10,6 и 11,1 для папаина, химопапаинов и пептидаз, соответственно. Различаются эти группы ферментов и по содержанию титруемых свободных SH-групп. Ферменты первой и третьей групп содержат 1 SH-группу на молекулу белка, ферменты второй группы - 2.
Папаин является наиболее изученным ферментом, хотя на его долю приходится только около 5: общего содержания растворимого белка латекса дынного дерева. Молек. масса фермента, определенная Э.Смитом и др. на
основании скорости седиментации и диффузии, равна 20,7 кДа. Эта величина значительно ниже значения, полученного Болзом и Г.Лайнуивером (27 кДа) осмометрическим методом[13].
Молекула папаина состоит из одной полипептидной цепи и содержит 212 аминокислотных остатков. Характерной особенностью аминокислотного состава фермента является отсутствие остатков метионина.
Папаин относительно устойчив в нейтральной и слабощелочной среде, но быстро и необратимо теряет активность в области кислых значений рН. По сравнению с другими протеиназами растительного происхождения (например, бромелаином и фицином) папаин проявляет значительную устойчивость к действию повышенных температур.
Все ферменты латекса папайи являются цистеиновыми протеиназами. Они катализируют реакцию гидролиза белков по пептидным связям'
P -...-P -P CO-NHP'-P'-...-P' + H O
P -...-P -P COOH + NH P'-P'-..-P', где P и P' - остатки аминокислот.
Различные протеиназы латекса папайи обладают сходной специфичностью действия на белковые субстраты. Они способны гидролизовать практически любые пептидные связи, за исключением связей, образованных остатками пролина. Предпочтительно расщепляются связи, в образовании которых в качестве остатка P участвуют глицин, гидрофобные (лейцин, изолейцин), ароматические (тирозин, фенилаланин) аминокислоты, а также аспарагиновая, глутаминовая и цистеиновая кислоты. Важное значение при этом имеет и природа остатков P и P'. Так, при действии на В-цепь окисленного инсулина пептидная связь между Leu-17-Val-18 гидролизуется только папаином, связь между Arg-22- Пдн-23 - только химопапаином и между Leu-15-Tyr-16 - только пептидазой А.
Протеиназы латекса обладают высокой протеолитической активностью в широком интервале значений рН. При этом папаин и пептидаза А гидролизуют гемоглобин, казеин и бычий сывороточный альбумин с наибольшей скоростью в зоне рН от 7,2 до 10, химопапаин проявляет наивысшую активность в зоне рН от
5,0 до 7,0.
Протеиназы латекса папайи способны катализировать гидролиз ряда синтетических эфиров и амидов аминокислот и пептидов'
R-С(=O)-R' + H O R-С(=O)-OH +HR', где R - остаток ациламинокислоты или ацилпептида, R' - остаток аминокислоты, спирта или гамма-нитроанилина.
Протеиназы латекса различаются по характеру действия на низкомолекулярные синтетические субстраты. Из таких субстратов наиболее предпочтительными являются эфиры и амиды N,альфа-бензоил-L-аргинина. При этом скорость их расщепления папаином выше, чем химопапаином и пептидазой А. Этиловые эфиры N-ацетил-L-тирозина, N-бензо- ил-L-тирозина и N-бензиол-L-лейцина полностью устойчивы к действию всех протеолитических ферментов латекса, в то время как амид бензоилглицина, некоторые производные L-лейцина и карбобензокси-L-глута- мил-L-тирозина медленно гидролизуются только химопапаином.
Агрегатное состояние при комнатной температуре – твердое кристаллическое вещество. Изоэлектрическая точка (pI) папаина находится при pH равным 8,75. Константа седиментации (s) = 2,42 единиц Сведберга Константа диффузии (D) = 10,23 см/сек2
Молекулярный вес папаина – 23406. Папаин – полипептид, состоящий из 212 аминокислотных остатков, на N-конце молекулы которого аминокислотой является изолейцин, на C-конце – аспарагин. Хорошо растворим в воде, водных солевых растворах и в 70% метиловом и этиловом растворах.
Аминокислота Содержание в полипептидной цепи фермента
Аланин 13
Аргинин 10
Аспарагиновая кислота 17
Валин 15
Гистидин 2
Глицин 23
Глутаминовая кислота 17
Изолейцин 10
Лейцин 10
Лизин 9
Цистеин 8
Пролин 9
Серин 11
Треонин 7
Триптофан 5
Тирозин 17
Фенилаланин 4
Папаин — монотиоловая цистеиновая эндопротеаза. По характеру ферментативного действия ее называют «растительным пепсином». Но в отличие от пепсина, папаин активен не только в кислых, но и в нейтральных и щелочных средах (диапазон pH 3—12, оптимум pH 5-8). Он сохраняет
активность в широком температурном диапазоне (до 50-60°C), обладает относительно широкой специфичностью. При pH 5-7,5 папаин гидролизует амиды, пептиды, белки и эфиры основных аминокислот с незамещенной аминогруппой.[4].
Активирует фермент Обратимо инактивирует фермент Необратимо инактивирует фермент
цистеин, этилендиаминтетраацетат, восстановленный глютатион, сульфиды, цианиды, п-хлормеркурибензонат, ионы тяжелых металлов, некоторые окислители иодацетамид
Получение.
Получают папаин из сока дынного дерева или фракционированием сухого сока дынного дерева сульфатом аммония, хлористым натрием с последующей кристаллизацией.
Do'stlaringiz bilan baham: |
