O’zbekiston respublikasi oliy va o’rta maxsus ta’lim vazirligi qarshi Davlat universiteti Kimyo biologiya fakulteti biologiya yo’nalishi 018-60 gurux talabasi Abduraxmonova Dilbarning Bioinformatika fanidan tayyorlagan kursi sh I reja

CYP21genini amplifikatsiya qilish uchun ishlatilgan praymerlar:
Forward (U1-F) 5’-GAGTACCTTGGAGGGCCTGCT-3’;
Reverse (F3-R) 3’-GCTACACTCCAGCGTCTGAGG-5’.
PZR-amplifikastiyani o’tkazishda quyidagi dastur yordamida olib boriladi.
2- jadval. PZR-amplifikatsiyasini o’tkazish dasturi

Bosqich	Harorat,°C		Vaqt,min	Sikl
Denaturatsiya	95.0		4:00	1
	94.0		0:20	45
Renaturatsiya	64.0		0:40
Elongatsiya	72.0		3:00
Yakunlovchi elongatsiya	72.0	5:00		1

Amplifikatsiya tugagandan so’ng, hamma probirkalarni elektroforez xonasiga ko’chiriladi va 5-10 mkl PZR mahsuloti 1,2 % elektroforez usuli bilan aniqlanadi.

7. 
   Agaroza gelida elektroforez qo’yish
   

Agaroza gelidagi elektroforez – standart metod bo’lib, DNK fragmentlarini tozalash, aniqlash va ajratishda foydalaniladi. Agaroza gelidagi elektroforezda TBE bufer sistemasi ishlatiladi. Bufer 121 g Tris, 55 g Bor kislota, 7,55 g EDTA moddalaridan tashkil topib, ular ozgina (500 ml) distillangan suv bilan magnitli aralashtirgich yordamida aralashtiriladi. So’ng 1 l ko’rsatkichigacha distillangan suv qo’shiladi. Bunda 10×TBE bufer tayyorlanadi va undan keyinchalik 0,5×TBE bufer tayyorlanadi. Bunda 500 ml 0,5×TBE bufer tayyorlash uchun 10×TBE buferdan 25 ml o’lchab olinadi va 500 ml gacha distillangan suv (dH₂O) qo’shiladi.
Zonali elektroforezni olib borishda agar geli tashuvchi muhit hisoblanadi. 0,8-0,9% li agaroza gelida DNK fragmentlari erkin harakatlanadi.
CYP21 genining PZR-mahsuloti agaroza gelidagi elektroforezda tekshiriladi.
Agaroza geli quyidagicha tayyorlandi: 1,2 gramm agaroza va 100 ml 0,5×TBE ni 200 ml li toza kolbaga solib, mikroto’lqinli pechda eritiladi. Agaroza to’liq erigandan so’ng, 50-60°C gacha sovutiladi, etidium bromiddan 7 mkl solinadi (1mg/ml) va sekin-asta aralashtiriladi. So’ng biroz xona haroratiga qo’yiladi. Gelda o’yiqchalarni hosil qilish uchun taglikka taroqcha o’rnatiladi. Avval tayyorlab qo’yilgan forez tagliklariga agaroza gelini quyiladi. Agaroza geli xona haroratida 10-15 minutlardan keyin polimerlanadi. Gel elektroforez kamerasiga ko’chiriladi va 0,5xTBE–bufer solinadi (bufer gel yuzasini 0,3-0,5sm ga yopishi kerak). Geldagi o’yiqchalarga 3-10 mkl PZR mahsulotini bo’yoq (bromfenol-ko’ki, ksilentsianol) bilan aralashtirib solinadi. So’ngra elektroforezga 120 V energiya manbaiga ulanadi; 1-1,5 soat vaqt mobaynida kuzatiladi.
Agaroza gelining tiniqligi DNK fraktsiyalarini yaxshi bo’yashni va fotometrik uslubda aniqlashni osonlashtiradi.
Elektroforez tugaganidan so’ng, amplikonlar transillyuminator oynasida ultrabinafsha nurlari ta’sirida ko’riladi. Gelni suratga olishda kompyuterga ulangan transillyuminator (WiseDoc, Korea) dan foydalaniladi. Birinchi navbatda nazorat namunalari baholanadi. Elektroforetik yo’lakchada, musbat nazoratga muvofiq, oq chiziq bo’lishi kerak. Uning elektroforetik harakatchanligi amplikon uzunligi qo’llanmasiga mos bo’lishi kerak. Elektroforetik yo’lakchada manfiy nazoratda chiziq bo’lmaydi. Agar manfiy nazoratda qandaydir rang bo’lsa, bunday holda o’rganilayotgan DNK yoki amplikonga ishlatilgan reagentlarning ifloslanganligidan dalolat beradi. Demak, namunalardagi chiziqlarni musbat nazorat namunadagi chiziqlarga nisbatan taqqoslanadi. Chiziqni yoritilish intensivligi namunada o’rganilayotgan DNK ni miqdoriga mos bo’ladi va bu – PZR o’tkazilganligini baholashga imkon beradi. Agarda namunadagi chiziqni yorqinligi juda kuchsiz bo’lsa, bunday namunani qayta tekshirish zarur.
Gel-elektroforezda CYP21 genining PZR-mahsulotlari fragmentlarini intensivligiga qarab probirkalardagi PZR-mahsulotlari bir necha martagacha suyultirildi (distillangan suv bilan) va real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya o’tkazishga tayyorlanadi.

8.