O’zbekiston respublikasi oliy va o’rta maxsus ta’lim vazirligi qarshi Davlat universiteti Kimyo biologiya fakulteti biologiya yo’nalishi 018-60 gurux talabasi Abduraxmonova Dilbarning Bioinformatika fanidan tayyorlagan kursi sh I reja

Polimeraza zanjir reaksiyasi uslubining xilma xilligi

• 
  Hosil qilingan PZR (Nested PCR (angl.) – reaksiyada hosil bo’ladigan qo’shimcha mahsulotlarning kamayishini ta’minlash uchun ishlatiladi. Ikki juft praymer ishlatiladi va ikkita ketma-ketlikdan iborat reaksiyalar o’tkaziladi. Birinchi reaksiya mahsuloti ichida ikkinchi juft praymer DNK qismini amplifikatsiyalaydi.
  
• 
  Invertirlanuvchi PZR (Inverse PCR (аngl.) – faqat kerakli ketma-ketlik ichidagi ma’lum katta bo’lmagan qism ishlatiladi. Bu metodning foydali tomoni shundaki, qachonki genomga DNK qo’yilgandan keyin yonma-yon joylashgan nukleotid ketma-ketligi aniqlanishiga imkon beradi. Invertirlanuvchi PZRni amalga oshirish uchun oxirgi fragment birikmalaridan bir qancha kesuvchi DNK restriktazalari ishlatiladi. Ma’lum fragmentlarning noma’lum qismning har ikkala oxirlarida bo’lishi natijasida xuddi oddiy PZR ni o’tkazish imkoni tug’iladi.
  
• 
  Teskari transkripsiyali PZR (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (angl.))- amplifikatsiya uchun yoki RNK kutubxonasidan ma’lum ketma-ketliklarni identifikatsiya qilish, ajratib olish uchun ishlatiladi. Oddiy PZR dan oldin matritsali mRNK da revertaza yordamida bir zanjirli DNK molekulasi sintezlanib, bir zanjirli kDNK hosil qilinadi, bu esa PZR uchun matritsa sifatida ishlatiladi. Bu metod ushbu genning qayerda va qachon ekspressiyalanishini aniqlashda keng ahamiyatga ega.
  
• 
  Asimmetrik PZR (angl. AsymmetricPCR) – qachonki dastlabki DNK zanjiridan ko’pincha bitta amplifikatsiyalash kerak bo’lgandagina o’tkaziladi. Bu bir qancha metodikalarda ham ishlatiladi. Masalan, sekvenirlash va gibridizatsiyali tahlil metodikalarida asimmetrik PZR keng qo’llaniladi. PZR oddiy o’tkaziladi, bundan tashqari praymerlardan biri ortiqcha miqdorda olinadi. Ushbu metodning modifikatsiyalangan ko’rinishlaridan biri - LATE-PZR (angl. Linear-After-The-Exponential-PCR) bo’lib, bunda praymerlarning turlicha konsentratsiyalari ishlatiladi, ko’p hollarda yuqori konsentratsiyali praymerlarga qaraganda, past konsentratsiyali praymerlar tanlanadi. Bu esa praymerlarning erish harorati bilan tushuntiriladi. PZRda renaturatsiya yuqori haroratda o’tkaziladi, bu esa hamma sikldagi reaksiyalar samaradorligi ushlab turishga xizmat qiladi [15].
  

• 
  Miqdoriy PZR (Quantitative PCR, Q-PCR (angl.)) yoki aniq vaqtdagi PZR-
  

har bir sikl reaksiyalarida hosil bo’ladigan ma’lum PZR mahsuloti miqdorini o’lchash, bevosita kuzatish uchun ishlatiladi. Bu metodda reaksiya mahsuloti miqdorini uning to’planishiga muvofiq aniq o’lchash uchun fluoressentli-nishonlangan praymerlar yoki DNK-zondlar ishlatiladi. Zondlar ikki qismdan iborat. Biri – fluoressentsiyani beruvchi fluorofor va ikkinchisi fluorofor energiyasini yutuvchi hamda fluoressentsiyani o’chirish vazifasini bajaruvchi to’sqinlik qiluvchidan iboratdir (7-rasm). Yoki ikki zanjirli DNK bilan bog’lanuvchi fluoressentli bo’yoq Sybr Green I (SYTO 13 ni ishlatish maqsadga muvofiq) ishlatiladi.

7-rasm. DNK zondining sxematik ko’rinishi
Aniq vaqtdagi PZR da zarur bo’lgan spetsifik fluoressentli zondlar yoki praymerlar bo’lmaganda ham PZR mahsulotini miqdoriy aniqlashda va detektsiya qilish uchun Sybr Green I eng oddiy va tejamli variant hisoblanadi. Sybr Green I bo'yog’i bilan amplifikatsiya qilinganda PZR mahsulotida kichik DNK egatcha o’rnatiladi va ko’k lazer nurlanishida bog’lanmagan fluoressent bo’yog’i signali chiqariladi. Aniq vaqtdagi PZR o’tkazish uchun bugungi kundagi ma’lum bo’lgan asboblarga Sybr Green I mos keladi. Sybr Green I uchun maksimum to'lqin uzunligini yutish 494 nm li to’lqin uzunligida joylashgan. Bundan tashqari, bo’yog’ning spektri 2 ta katta bo’lmagan maksimum to’lqin uzunligini yutishga ega, ular-290 nm va 380 nm. SYBR Green I uchun maksimum nurni tarqatish to’lqin uzunligi 521 nm ga teng (spektda yashil rangga mos keladi ) [16].

• 
  Pog’onali PZR (Touchdown PCR (аng.))- bu usul yordamida praymerlarning nospetsifik bog’lanishlarga ta’sir kamaytiriladi. Birinchi sikl renaturatsiyaning optimal haroratidan yuqori harorat bilan o’tkaziladi, keyin bir qancha sikllardan keyin renaturatsiya harorati asta-sekin optimal haroratgacha pasaytiriladi. Bu praymerlarni o’z uzunligiga mos ravishda komplimentar zanjirlar bilan gibridizatsiyalanishi uchun yaratilgan imkoniyat sifatida qaraladi. Ya’ni renaturatsiyaning optimal haroratida komplimentar zanjir bilan praymerlarning qisman gibridizatsiyalanishi sodir bo’ladi. Genom DNK ga praymerlarning qisman gibridizatsiyalanishi nospetsifik amplifikatsiyaga olib keladi. Ko’p hollarda PZR ning birinchi o’nta siklida renaturatsiya harorati 72-75°С da o’tkazilishi mumkin. Keyin birdaniga harorat optimal haroratgacha tushiriladi, masalan, 60-65°С gacha.
  
• 
  Molekulyar koloniya metodi (Geldagi PZR, аngl. Colony - PCRColony)-
  

Akrilamid gel yuzasida PZRning hamma komponentlari polimerizatsiyalanadi va PZR o’tkaziladi. Tahlil qilinuvchi DNK da amplifikatsiya jarayoni molekulyar koloniya hosil bo’lishiga olib keladi.

• 
  Uzun fragmentlar PZRi (аngl. Long-rangePCR)- PZR modifikatsiyasi DNK qismlari ko’lamini (10.000 va undan ko’p azot asosli) amplifikatsiya qilish uchun qo’’laniladi. Bunda 2 ta polimeraza aralshmasi ishlatiladi, ulardan biri Taq-polimeraza (DNK uzun zanjirini sintezi uchun zarur), ikkinchisi esa 3'-5' faolligiga ega DNK polimeraza bo’lib, unga odatda Pfu-polimeraza kiradi. Ikkinchi polimerazani ishlatishdan maqsad, turli xatoliklarni to’g’irlashdan iboratdir. Agar Taq-polimeraza nokomplimentar nukleotidga qo’shilganda DNK sintezini to’xtatadi. Ana shunday nokomplimentar nukleotidlarni Pfu-polimeraza parchalab tashlaydi. Ushbu polimerazalar aralashmasi 50:1 nisbatda va hatto undanda kam nisbatda 100:1 nisbatda olinadi. Odatda Taq-polimeraza 25-100 martta Pfu-polimerazaga nisbatan ko’proq olinadi.
  
• 
  RAPD PZRi (аngl. Random Amplification of Polymorphic DNA)- polimorf DNK ni tasodifiy amplifikatsiya qiluvchi PZR bo’lib, organizmlarni genetik ketma-ketlik yaqinligi bo’yicha ajratishda ishlatiladi, masalan, madaniy o’simliklarning turli navlari, itlarning turlari, mikroorganizmlarning bir-biriga yaqin turlari va boshqa organizmlarning genetik yaqinligini o’rganishda keng qo’llaniladi. Bu metodda faqat bitta praymer ishlatiladi. Praymer o’lchami ham uncha katta bo’lmasligi lozim (10 juft nukleotidga teng ). Bu praymer tadqiq qiluvchi organizmning tasodifiy DNK qismiga qisman komplimentar bo’ladi. Ikki organizm uchun sharoitlar tanlash (praymer uzunligi, uni tarkibi, harorati va h.k) qoniqarli farqga ega bo’lish imkonini beradi.
  
• 
  Guruh-spetsifik PZRi (аngl. group-specific PCR)- bir yoki har xil tur orasidagi yaqin ketma-ketliklarni aniqlashga qaratilgan metod bo’lib, bunda ushbu ketma-ketliklarga konservativ praymerlar ishlatiladi. Masalan, ribosomal 18S va 26S genlarga universal praymer tanlash natijasida amplifikatsiya uchun tur spetsifikligi genlararo speysor ya’ni 18S va 26S genlari ketma-ketligi turlar orasida konservativ bo’lib, shuning uchun ham ushbu genlar orasidagi PZR hamma tadqiq qilinayotgan turlar uchun mos keladi. Ushbu metodga qarama-qarshi metod bo’lib – unikal PZR (аngl. uniquePCR) hisoblanadi. Bunda praymer tanlash vazifasi muhim o’rin tutib, amplifikatsiya qilish uchun faqat yaqin ketma-ketliklar orasidan aniq ketma-ketlik tanlab olinadi.
  
• 
  Issiq start ishlatiladigan PZR (аngl. Hot-startPCR)- PZR ning modifikatsiyasi bo’lib, DNK-polimeraza ishlatiladi, xona haroratida antitana yoki antitanaga o’xshash uncha katta bo’lmagan Affibody molekulalari polimeraza faolligini bloklaydi, ya’ni reaksiyani qo’yishdan boshlab to birinchi denaturtasiyagacha bo’lgan vaqtda amalga oshadi. Odatda birinchi denaturatsiya 95 °C da 10 minut oralig’ida o’tkaziladi.
  
• 
  Virtual PZR (аngl. Insilico PCR, raqamli PZR, elektronli PZR, е-PZR)-nazariy polimeraza zanjir reaksiyasining kompyuterli tahlil qiluvchi matematik metod bo’lib, praymer ketma-ketligi ro’yhatini ishlatish bilan (yoki DNK-zondlarni) tadqiq qilinuvchi genom, DNK halqasi, xromosomadagi DNK ni potensial amplifikatsiya qilishni oldindan aytish imkonini beradi.