O’zbekiston respublikasi oliy va o’rta maxsus ta’lim vazirligi qarshi Davlat universiteti Kimyo biologiya fakulteti biologiya yo’nalishi 018-60 gurux talabasi Abduraxmonova Dilbarning Bioinformatika fanidan tayyorlagan kursi sh I reja

Dezoksiribonukleozidtrifosfatlar-(dATF, dGTF, dCTF, dTTF).

Mg²⁺ ioni, DNK-polimeraza ishlashi uchun zarur bo’lgan ion hisoblanadi.

Bufer eritma, reaksiya sharoitini yaxshi ta’minlash uchun zarur bo’lgan pH, eritmaning ion kuchi uchun kerak, tarkibida tuz, buqa qon zardobidagi albumin bo’ladi.

Reaksiya aralashmasining bug’lanib ketmasligi uchun probirkalarga yuqori qaynovchi yog’ qo’shiladi, masalan, vazelin qo’shiladi. Agar amplifikatorda iliq qopqoqlar ishlatilayotgan bo’lsa, bu maqsadga muvofiq kelmaydi. Reaksiya aralashmasining tarkibiga pirofasfatazaning qo’shilishi PZR reaksiyalarini chiqishini ko’paytirishi ham mumkin. Bu ferment pirofosfatning gidroliz reaksiyalarini katalizlaydi, qo’shimcha mahsulot nukleotidtrifosfat o’suvchi DNK zanjiriga toki ortofosfatgacha birikadi. Pirofosfat PZR reaksiyalarini ingibirlashi ham mumkin [10].
Labaratoriya sharoitida polimeraza zanjir reaksiyasi uslubini o’tkazish uchun quyidagi asboblar zarur bo’ladi:

1. 
   Amplifikator (yoki termosikler deb ham nomlanadi);
   
2. 
   Tok manbai bilan gel-elektroforez sistemasi (PZR natijalarini visual kuzatish uchun);
   
3. 
   Gel-dokumentatsiya (PZR natijalarini tahlil qilish uchun);
   
4. 
   PZR-boks (namunalarni tayyorlash uchun);
   
5. 
   Vortex;
   
6. 
   Avtomatik dozatorlar to’plami (mexanik yoki elektronli).
   

Praymerlar
Polimeraza zanjir reaksiyasi uslubining spetsifikligi matritsa va uzunligi 18-30 juft azot asoslaridan iborat qisqa sintetik oligonukleotid bo’lgan praymer orasida komplementar kompleks hosil bo’lishiga asoslangan. Har bir praymer ikki zanjirli matritsaning bir zanjiriga komplementar bo’ladi va amplifikatsiyalanuvchi fragmentning boshi va oxirini chegaralashi kerak. Matritsaning praymer bilan o’zaro gibridizatsiyasidan so’ng [11] oxirgisi matritsaning komplementar zanjirining sintezida DNK-polimeraza uchun tomizg’I sifatida xizmat qiladi. Praymerning muhim xususiyatidan biri praymer-matritsa kompleksining erish haroratidir (T_m). T_m – DNK – matritsaning oligonukleotidli praymer bilan hosil qilgan kompleksining yarmiga teng bo’lgan erish haroratidir.
Praymerning nukleotid tarkibi, uzunligi yoki renaturatsiyaning haroratini noto’g’ri tanlash oqibatida komplementar komplekslarning boshqa matritsali DNK bo’lagi bilan bog’lanishiga olib kelib, nospetsifik mahsulotlar paydo bo’lishiga sababchi bo’lishi mumkin. Praymerning yuqori erish harorati polimerazaning optimal ta’sir qilish harorati bilan chegaralangan, 80 °C dan yuqori bo’lgan haroratda praymer faolligi pasayishi mumkin.
Praymer tanlashda quyidagi kriteriyalarga ahamiyat berish maqsadga muvofiqdir:

• 
  GS-tarkibning ~ 40—60 % bo’lishi;
  
• 
  Praymerning erish haroratiga (T_m) yaqin bo’lishi (farqi 5 °C dan ko’p bo’lmasligi);
  
• 
  Nospetsifik mahsulotlar – shpilkalar (Shpilka — molekula ichidagi o’z-o’ziga komplimentar bo’lgan struktura) [12] va dimerlarning (Dimer – molekulalar orasidagi struktura bo’lib, praymerlarning o’zaro birikib qolishi natijasida kelib chiqadi) [13] bo’lmasligi;
  
• 
  3’-oxiriga guanin yoki sitozinning bo’lishi maqsadga muvofiqdir, chunki ularning qancha ko’p bo’lishi gibridizatsiya jarayonini stabilligini oshiradi. Buni guanin va sitozin orasidagi 3 ta vodorod bog’ mavjudligi bilan tushuntirish mumkin.
  

Polimeraza zanjir reaksiyasi uslubi o’tkaziladigan amplifikator asbobi
Polimeraza zanjir reaksiyasi uslubi amplifikator asbobida o’tkaziladi, probirkalarni davriy sovutish va isitish ta’minlanadi, odatda davriy sovutish va isitish 0,1 °C dank am bo’lmagan aniqlikda amalga oshiriladi. Zamonaviy amplifikator asboblari murakkab dasturlar yuklatishni talab etadi, shu jumladan Touchdown PZR ning “issiq start” imkoniyati bilan va oxirgi amplifikatsiyalanuvchi molekulaning 4 °C da saqlanib turishini misol qilib keltirishimiz mumkin. Real vaqtdagi PZR da maxsus fluoressent detektor jihozining bo’lishi ham fikrimizning yorqin dalilidir. Shuningdek, avtomatik qopqoq bilan va mikroplanshet uchun maxsus joy ajratilgan.

2-rasm. Amplifikator asbobi
Polimeraza zanjir reaksiyasi uslubi reaksiyasining ketishi:
Odatda Polimeraza zanjir reaksiyasi 20-35 sikldan iborat, har bir sikl 3 ta bosqichdan iborat. Ular:

• 
  Denaturatsiya
  
• 
  Renaturatsiya
  
• 
  Elongatsiya
  

Denaturatsiya
2 zanjirli DNK-matritsa 94—96° C gacha (yoki 98 °C gacha, agar maxsus termostabil polimeraza ishlatilayotgan bo’lsa) 0,5—2 minutgacha isitiladi, bundan ko’zlangan asosiy maqsad esa DNK zanjirini 2 ga ajratishdir. Bu bosqich denaturatsiya deyiladi, DNK ning 2 zanjiri orasidagi vodorod bog’lari uziladi. Ba’zida 1-sikldan oldin (polimeraza qo’shulguncha) dastlabki isitilgan reaksiya aralashmasi 2-3 min davomida praymer va matritsaning to’liq denaturatsiyasi uchun olib boriladi. Bunday usul “ issiq start” deyiladi, u nospesifik reaksiya mahsulotlarini hajmini tushuradi.

3-rasm. Denaturatsiyaning sxematik ko’rinishi
Renaturatsiya
Qachonki DNK zanjiri 2 ga ajralganda harorat pasayadi, bunda praymerlar bir zanjirli matritsa bilan aloqaga kirishadi. Bu bosqich renaturatsiya deyiladi.
Renaturatsiya harorati praymer tarkibiga bog’liq va odatda uning erish haroratidan 4-5 °C past tanlanadi. Renaturatsiya bosqichining vaqti — 30sekunddan iborat, bir vaqtning o’zida, 30 sekund ichida polimeraza yuzlab nukleotidlarni sintezlashga ulguradi. Shuning uchun praymerning harorati 60 °C dan yuqori erish haroratini tanlash tavsiya etiladi. Bunda bir vaqtning o’zida renaturatsiya va elongatsiyani 60-72 °C harorat orasida o’tkaziladi. Renaturatsiyada noto’g’ri tanlangan harorat praymerning 1 zanjirli matritsa bilan yomon bog’lanishiga sababchi bo’ladi. (yuqori haroratda),bunda noto’g’ri joyiga o’tirib olishidan nospesifik mahsulotlar hosil bo’ladi (past haroratda).

4-rasm. Renaturatsiyaning sxematik ko’rinishi
Sintez (Elongatsiya)
DNK-polimeraza matritsa zanjirini replikatsiyalaydi, praymerni tomizg’i sifatida ishlatadi. Bu bosqich –elongatsiya deyiladi. Polimeraza 2-zanjirni praymerning 3'- oxiridan boshlab sintezlaydi, matritsa bilan aloqaga kirishadi va matritsaning uzunasi tomon harakatlanadi, yangi zanjirni 5'dan 3' ga tomon sintezlaydi.
Elongatsiya harorati polimerazaga bog’liq. Tez-tez ishlatiladigan polimerazalardan Taq va Pfu polimerazalar 72°C da faol bo’ladi. Elongatsiya vaqti DNK-polimerazaga turi va amplifikatsiyalanuvchi fragment uzunligiga bog’liq. Odatda, elongatsiya vaqti sifatida har qaysi minglab azot asoslari juftligiga 1 minut etib qabul qilinadi. Hamma sikldan so’ngra, qo’shimcha finalli elongatsiya bosqichi o’tkaziladi. Bundan ko’zlangan asosiy maqsad, hamma bir zanjirli fragmentni tiklashdan iborat. Bu bosqich 7-10 minutni o’z ichiga oladi.

5-rasm. Elongatsiyaning sxematik ko’rinishi

6-Rasm. PZR ning birinchi sikli sxematik ko’rsatilgan.

1. 
   94—96 °C da denaturatsiya;
   
2. 
   68 °C da renaturatsiya;
   
3. 
   72 °C da elongatsiya (P-polimeraza)
   
4. 
   1-siklning tugallanishi. Hosil bo’lgan 2 ta DNK zanjiri keying sikl uchun matritsa sifatida xizmat qiladi. Shuning uchun matritsali DNK ning miqdori har bir sikldan keyin ko’payib boraveradi.
   

Reaksiyaning spetsifik mahsulotlari miqdori nazariy 2ⁿ — 2n ga muvofiq proporsional tarzda o’sadi, n- reaksiya sikllari soni [14]. Shuni ham inobatga olish kerakki, har bir siklning samaradorligi 100 % dan kam bo’lishi mumkin, shuning uchun mahsulot miqdori va siklning o’rtacha samaradorligining o’zaro bog’liqligini nazarda tutushimiz kerak. Bunda mahsulot miqdori va siklning o’rtacha samaradorligining o’zaro bog’liqligini quyidagi formula yordamida ifodalaymiz, ya’ni P ~ (1+E)ⁿ bo’lib, bu yerda P-mahsulot miqdori, E-siklning o’rtacha samaradorligini bildiradi.
“Uzun” DNK nusxalari soni ham o’sadi, lekin ular chiziqli tarzda o’sadi, shuning uchun reaksiya mahsuloti spetsifik fragmentdan dominantlik qiladi.
Lozim bo’lgan mahsulotning miqdori geometrik progressiyaga muvofiq o’sadi, uning miqdori reagentlar miqdori bilan chegaralanadi. Bunda ingibitorlarning bo’lishi qo’shimcha mahsulotlar hosil bo’lishiga olib keladi. Siklning oxirgi reaksiyalarida o’sish sekinlashadi, bu “plato samarasi” deyiladi.

3.