Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Постановка метода иммунфлюоресценции при определении возбудителя сифилиса

1. 
   Берется тонкое и обезжиренное предметное стекло
   
2. 
   На заднюю сторону предметного стекла при помощи стекола рисуем 10 кругов диаметром 0,7 см.
   
3. 
   В круги капаем антигены (из тканевой культуры бледной трепонемы), в одном поле зрения трепонемы не должны превышать 50-60
   
4. 
   М азок высушивается на воздухе, затем фиксируется над племенем спиртоки и ацетона в течение 10 мин
   
5. 
   В отдельной пробирке смешиваем 0,2 мл сорбента и 0,5 мл сыворотки крови больного
   
6. 
   Смесь с осторожностью капаем на круги (антигены) на предметном стекле (поверхность антигена должен быть полностью покрытым смесью) и на 30 мин ставим на влажную камеру при 37⁰С (1фаза реакции) 56- rasm–oqish treponemalar
   
7. 
   После этого мазок промывается фосфатным буферным раствором, высушивается, затем на него капаем флюоресцирующий антиглобулин сыворотки кровина 30 мин ставим на влажную камеру при 37⁰С (2 фаза реакции)
   
8. 
   Мазок повторно промываем фосфатным буферным раствором, высушиваем, микроскопируем под люминесцентным микроскопом
   

Необходимо приготовить мазок для просмотра под микроскопом. Для этого на поверхность мазка тонким слоем наносим маленькую каплю глицеринового буферного раствора (1 часть буферного раствора и 9 частей глицерина), затем на ее поверхность капаем не люминесцирующее иммерсионное масло (диметилфталат), микроскопируем под люминесцентным микроскопом.
Если реакция положительная, то бледная трепонема дает золотисто-зеленое свечение.
При отрицательной реакции бледные трепонемы не светятся.


Реакция преципитации.
В отличие от реакций агглютинации в этом процессе дисперсные коллоиды связываются с антигенами ( преципитагенами) и при участии электролитов ( 0.85 % NaCl) образует осадок ( преципитаты – малый осадок), так называемый преципитины.
Антигены (точнее преципитагены), к ним относятся различные белковые вещества ( животное, растение и белки микроорганизмов), антигены многих термолабильных микроорганизмов (сибирской язвы) и возбудитель туяремии. Реакция преципитации является весьма чувстивительной и при помощи этой реакции можно определить разбавленный антиген (в соотношений 1:10) - гептан, .высокая чувствительность реакций преципитации способствует определению многих антигенов с помощью антисывороток. Для этого нужно капать разбавленный антиген в стандартную пробирку, содержащую сыворотку и через несколько минут в пробирке появляется соединение антитело-антигена в виде белых колец и так можно определить титр.
Реакция преципитации применяется:
1. Для диагностики инфекционных заболеваний (сибирской язва,туляремия, чума и другие)
2. Для определения видов бактерий
3.В практике судмед экспертизы, .например: определение группы крови и спермы
4. В санитарной экспертизе применяют для определения поддельных продуктов ( молоко,мясо, рыба, мёд и другие). Важно отметить что, реакция Асколи (реакция термопреципитации) имеет важное значение в серодиагностике. Суть реакции Асколи заключается в том,что возбудитель сибирской язвы в своем составе содержит о-соматический (полисахарид) АГ. Антиген возбудитель отличается тем,что эти антигены являются очень термостабильным. Поетому этот антиген долго сохраняется во внешней среде ( коже животных, шерсти).
Эти материалы в прокипиченном экстракте сохраняют полисахариды АГ и после добавлении сывороток наблюдаются реакция преципитации.

57- rasm. Prestipitastiya reaksiyamexanizmi (sxemasi)

Постановка реакции термопреципитации Асколи

Ингредиенты, мл	Опытные пробирки	контрольные пробирки№
		1	2	3	4
Преципитоген сибирской язвы	0,3	−	0,3	0,3	0,3
Сыворотка кролика	−	0,3	−	−	−
Игредиенты капают медленно, осторожно по стенке
Проверяемый термоэкстракт	0.3	0.3	−	−	−
Стандартный антиген сибирской язвы	−	−	0.3	−	−
Контроль: нормальный термоэкстракт	−	−	−	0.3	−
Изотонический раствор	−	−	−	−	0.3
Результаты