|
Тема лабораторной работы №14
«СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РЕАКЦИИ ПРЯМОЙ И КОСВЕННОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ».
Цель лабораторной работы.
Ознакомление с серологической диагностикой инфекционных заболеваний - реакция связывания комплемента, прямой и косвенной гемагглютинации.
Педагогические задачи
- объяснить значение серологической диагностики инфекционных заболеваний - реакции РСК;
- рассказать о сущности РПГ и РНПГ и их механизмы;
-показать на интерпретацию результатов реакции и применение на практике.
Результаты лабораторной работы
-студент должен знать:
-сущность серологической диагностики инфекционных заболеваний и ее значение;
- цель применения в диагностике реакций РСК, РПГ,РНПГ;
- интерпретацию результатов реакции и применение на практике.
Студент должен выполнить:
- реакцию связывания комплемента и его анализ;
- реакции РПГ и РНПГ и его анализ
- интерпретировать результаты реакции и применить на практике
Теоретическая часть
Реакция связывания комплемента. Входит в состав сложных серологических реакций, в этой реакции кроме антигена, антител и комплемента применяется гемолитическая система. В связи с тем, что РСК обладает высокой чувствительностью, широко применяется для диагностики инфекционных заболеваний. (Например, заболевания вызываемые вирусами, риккетсиями, не только бактериями). Часто применяется для определения типа и идентификации вирусов, выделенных от пациентов.
РСК состоит из двух фаз:
С хема РСК с сывороткой больного. Схема РСК с сывороткой здорового
Рисунок 58. Схема постановки реакции связывания комплемента
Фаза связывания антигена, антитела и комплемента
Фаза гемолитической системы
Сущность первой фазы в том, что в этой фазе антигены и антитела специфически реагируют друг с другом (рисунок), образуется соединение, в результате чего активизируется комплемент и связывается с комплексом (расходуется комплемент). При постановке реакции в пробирке, невозможно будет увидеть реакцию. Поэтому применяем вторую систему (фазу), т.е. гемолитическую систему. Гемолитическая система выполняет индикаторную функцию в ходе реакции. Гемолитическая система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, т.е. антител. Для получения такой гемолитической сыворотки эритроциты барана вводят лабораторным животным (кроликам) несколько раз и от них получают гемолитическую сыворотку. Гемолитическая сыворотка инактивируется на водяной бане при температуре 560С (при этом комплемент теряет активность). РСК также как и другие серологические реакции протекает в 2 фазы:
Антиген- антитело
Адсорбция комплемента
Т.е. РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы — опытная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реакции прогревают при 56 °С в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена.
К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь инкубируют при 37 °С в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образующиеся комплексы "антиген + антитело" свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса "антиген + антитело" не произойдет, и комплемент останется свободным.
Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяснения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроциты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37 °С в течение 30—60 мин, после чего оценивают результаты реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом "антитело + антиген", лизиса эритроцитов не будет — РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов.
Если же в сыворотке специфические антитела отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произойдет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе комплемент связывается с комплексом "эритроциты + антитела" индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и контроль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию.
Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20—25% по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10% раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °С.
Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаружения специфических антител. В качестве носителя антигенов используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических антител сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.
Если в сыворотке крови больного имеются специфичные антигены для антител реакции, то образовавшееся соединение антиген-антитела связывает комлемент. При добавлении в него гемолитической системы, не происходит гемолиза (рисунок), потому что комплемент находится в связонном состоянии (т.е. израсходован), на вторую гемолитическую систему (АГ+АТ) не остается комплемент. Поэтому не происходит гемолиза в пробирке. РСК считается положительной.
Гемолитическая система –гемолитическая сыворотка крови+эритроциты барана (в соотношении1:1), гемолитическая сыворотка крови, инактивированная (при 560С в течение 30 мин на водяной бане) сыворотка крови кролика, получается путем гипериммунизации кролика эритроцитами барана. Титр гемолитической сыворотки 1 : 1200, а рабочее разведение 1 : 400.Суспензия эритроцитов барана готовят из дефибрированной крови барана, эритроциты обесцвечивают раствором хлорида натрия в центрифуге, затем готовят из него 3 % суспензию изотонического раствора хлорида натрия.Для постановки РСК как рабочую дозу используют трижды титрованную гемолитическую сыворотку. После определения титров всех ингредиентов и рабочих доз ставится основная реакция РСК (таблица). При температуре 560С в течение 30 мин инактивируется комплемент исследуемых и контролируемых сывороток.
В первой фазе реакции РСК происходит связывание антигена с исследуемой сыворотки крови и комплементом при 37º Св течение 30 минут. Если реакция проводится в холодных условиях, то это фаза протекает при 0-4 º С в течение 18-20 часов.Добавляем в каждую пробирку по 0,4 мл гемолитической системы, встряхиваем и оставляем в термостате при 37º С на 20-30 мин.Оцениваем результаты РСК по реакциям гемолиза (таблица 1). Если в пробирке жидкость прозрачная, эритроциты осаждены (при инкубировании при0-4 º С в течение 18-20 часов) и совсем нет гемолиза, то реакция положительная. Если все эритроциты растворяются и окрашивают жидкость в равномерно красный цвет, то реакция отрицательная. При всех методах инкубации результаты оцениваются по схеме:
(++++) – гемолиза нет, (+++) – гемолиз 25%,(++) – гемолиз 50%,(+) – гемолиз 75%,(+) – все эритроциты подверглись гемолизу.
В первом и во втором случае реакция считается положительной.
Do'stlaringiz bilan baham: |
