Evolyusion jarayonning o’rganish metodlari. T. I.: «uch parallel uslubi», morfologik, embriologik va paleontologik usullar, biogeografik va sistematik usul, genetik, molekulyar biologik va immunologik usullar

«Plyus-minus» metodi. «Plyus-minus» metodi birinchi marta 1975 yilda F.Senger va A.Koulson tomonidan taklif etilgan va fermentativ reaksiyalarga asoslangan. Bu usul genomning o’rganilayotgan qismiga mos keluvchi bir zanjirli DNK fragmentini ajratishni nazarda tutadi. Bu fragment keyinchalik polimeraza-ko’paytirish uchun matrisa sifatida foydalaniladi. Bunda praymer sifatida sintetik oligonukleotidlar yoki ma’lum restrikzalar yordamida gidrolizlangan tabiiy subfragmentdan foydalaniladi. «Plyus-minus» metodining bosqichlari:
1.Birinchi bosqichda DNK polimeraza yordamida 4 xil nukleotidlar ishtirokida polimerizasiya reaksiyasi amalga oshiriladi. Bunda bitta nukleotid radioaktiv nishonlangan bo’ladi. O’rganilayotgan bir zanjirli DNK fragmentining to’liqsiz kopiyalari to’plamlarini olish maqsadida reaksiya cheklangan sharoitda o’tkaziladi.
2. Keyin polimerlar to’plami nukleotidlardan ajratiladi, aralashma 8 qismga ajratiladi va qo’shimcha polimerizasiya reaksiyalari davom ettiriladi. Qo’shimcha polimerizasiya reaksiyalari bitta nukleotid ishtirokisiz, 3 xil nukleotid ishtirokida («minus» sistema) yoki faqat bir xil nukleotid ishtirokida («plyus» sistema) o’tkaziladi. 3 xil nukleotid ishtirokida borayotgan reaksiyada («minus» sistema) matrisaga komplementar sintezlanayotgan barcha yangi zanjirlarda reaksiya aralashmada mavjud bo’lmagan eng yaqin nukleotidga borganda to’xtaydi. «Plyus» sistemada reaksiya aralashmada mavjud nukleotid joylashgan ketma-ketlikdan so’ng to’xtaydi.
3. 8 ta namunadan olingan aralashma bir vaqtning o’zida yuqori aniqlikdagi elektroforezdan o’tkaziladi. Elektroforez geli radioavtografiya qilinadi va radioavtografiyadan nukleotidlar ketma-ketligi o’qiladi. O’qilgan yakuniy ketma-ketlik dastlabki matrisaga komplimentar bo’ladi.
Sengerning didezoksi-metodi. «Plyus-minus» metodining kamchiligi shundaki, 1-bosqichda aniq statistik kopiyalar tuplamlarni olish juda qiyin. Shu sababli 1977 yilda Senger boshchiligida yangi uslub ishlab chiqildi. Bu usul didezoksinukleozidtrifosfatlar usuli deb nomlandi. Hozirgi vaqtda u Sengerning didezoksi-metodi nomi bilan yuritiladi. Bu usul asosida ham praymerning 3’-uchidan boshlanadigan DNK bir zanjirini polimeraza ishtirokida nusxasini olish yotadi. Polimerlanish reaksiyasi aralashmasida 4 xil nukleotidlar (dNTP) mavjud va ularning bittasi ³²R atomi bilan nishonlangan. Bundan tashqari aralashmaga nukleotidlarning sintetik analogi- 2’,3’-didezoksinukleozidtrifosfatlar (ddNTP) qo’shiladi. Bunda reaksiya terminasiyasi (to’xtashi) 2’,3’-didezoksinukleozidtrifosfatlar hisobiga amalga oshadi. DNK-polimeraza ddNTP DNK ning o’sib borayotgan zanjiriga ulash qobiliyatiga ega, lekin ddNTP zanjirga ulangandan keyin, zanjirning keyingi sintezi to’xtaydi, chunki ddNTP 3’-OH gruppaga ega emas.
4 ta probirkaga praymer eritmasi, 4 xil nukleodidlar dATP, dCTP, dGTP i dTTP saqlovchi aralashma (nukleotidlarning bittasi radiaktiv izotop bilan nishonlangan bo’ladi) va bir xil ddNTP solinadi. dNTP/ ddNTP konsentrasiyalari shunday tanlanadiki, reksiya determinasiyasi ddNTP ga komplimentar nukleotid mavjud har bir joyda sodir bo’lsin.

4. 
   ta probirkadagi ddNTP 4 xil bo’lishi zarur.