Biokimyo va molekulyar biologiya

21-gidroksilaza genidagi C1994T mutatsiyasini aniqlashda ishlatiladigan allel-spetsifik praymer va zondlar

Mutatsiya*	Praymer va zond nomlari**	Praymer va zondlar ketma-ketligi*** 5 ' 3'	Amplikon uzunligi j.n
C1994T	AW8-R	TTCGTGGTCTAGCTCCTCGTG	125
	AM8-R	GTTCGTGGTCTAGCTCCTCGTA
	A8- F	ACTCAGGCTCACTGGGTTGCT
	AP8	6FAMTGATCGGGTGGAGTCCTGCCBH1

*Nukleotidlarni raqamlanishi initsirlovchi ATG kodonining birinchi nukleotididan boshlanadi.

**Allel spetsifik praymerlar, AW yovvoyi tip alleliga, AM mutant alleliga mos tushadi; F – to‘g‘ri , R – tekari praymer; AP – TaqMan zondi.

***Matritsani nokomplementar nukleotidi.

PZR jarayonida renaturatsiya bosqichida DNK zondi DNKning komplimentar zanjiriga birikadi, qancha ko‘p amplifikatsiya mahsuloti hosil bo‘lsa, shuncha ko‘p zond molekulasi o‘ziga xos amplikonlar bilan birikadi. Elongatsiya bosqichida polimeraza komplementar DNK zanjirini sintezlaydi va zondga etganda 5'-ekzonukleaza faolligi yordamida uni parchalaydi. SHunday qilib, fluoretssent belgi va o‘chiruvchini ajralishi sodir bo‘lib, detektrlanayotgan yorug‘likni ko‘payishiga olib keladi. Ayonki, ayni vaqtda PZR davomida qanchalik ko‘p amplikonlar ishlab chiqarilsa shunchalik yorug‘lik intensiv bo‘ladi.

Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya uchun kerakli reagentlar to‘plami quyidagi funksiyalarni bajaradi: dd N₂O – erituvchi vazifasini bajarib, uning miqdori o‘zgarib turadi. PZR Buffer rN muhitni barqarorlashtirib turadi. dNTF–erkin dezoksinukleotidtrifosfatlar (dNTF - dATF, dSTF, dGTF, dTTF) bo‘lib, ular yangi DNK zanjiri uchun zarur. MgCl₂ – DNK zanjirini turg‘unligini ta’minlab turadi. Praymer – com (F, R) – DNKning ikkinchi zanjirini sintezlaydi. Praymer – ( angl. primer) – nishon DNK yoki RNKga komplimentar bo‘lgan qisqa nuklein fragmenti (oligonukleotid) bo‘lib, DNK-polimeraza yordamida komplimentar zanjirini sintezlash uchun “tomizg‘i” sifatida xizmat qiladi. ”Tomizg‘i” DNK-polimerazalar uchun yangi zanjirni praymerning 3'-uchidan (ONdan) sinto’zini initsiatsiyasi uchun kerak. DNK-polimeraza praymerni 3'-uchiga matritsa zanjiriga komplementar bo‘lgan nukleotidlarni qo‘shadi. Bu praymerlar umumiy. Primer – Wt (Mut) – bitta probirkaga yoki Wild ture, yoki Mutant solinadi. Zond – Real vaqtdagi natijani olish uchun ahamiyatli va u flouressensiyani beradi .Har bir CUR21 geni mutatsiyalari uchun alohida zondlar ishlatiladi. Tak-polimeraza–DNK zanjiri sinto’zini ta’minlaydi.

Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya uchun quyidagi ketma-ketlikdagi ishlar qilinadi: avval 2 ta probirkalarga Matser mix Mutant va Matser mix Wild Ture reaksiya aralashmalarini tayyorlab olinadi. Matser mix Wild Ture yovvoyi tip (mutatsiya yoq) allelini aniqlash uchun qo‘llaniladi. Matser mix Mutant (mutatsiya bor) esa mutant allelini aniqlash uchun qo‘llaniladi. Mutant allel va yovvoyi tip allelini aniqlash uchun allel-spetsifik oligonukleotidli praymerlar va amplikonga mos keluvchi Taq-Man zondi ishlab chiqarilgan. Fluorofor sifatida 6-karboksifluoretsen (FAM) yoki karboksi-X-rodamin (ROX) ishlatiladi. Ikkala probirkaga ham com praymeri ishlatiladi. Buning uchun har ikki probirkalarga 7.4mkl dan dd N₂O solinadi,ustiga esa 10x PZR Buffer dan 1.5 mkl dan solinadi, keyin dNTF dan 1.5 mkl solinib, ustidan MgCl₂ dan ham 1.5 mkl miqdorda solinadi, yanaPraymer com (Forward (A8_ACTCAGGCTCACTGGGTTGCT) dan 0.6mkl solinadi, keyin esa Matser Mix WT probirkasi uchun praymerWild Type AW8_R TTCGTGGTCTAGCTCCTCGTG praymeri ishlatilsa, Master Mix Mutant uchun esa AM8_R GTTCGTGGTCTAGCTCCTCGTA praymeri ishlatiladi. Bulardan mos ravishda 0.6mkl dan solinadi. Aniq natijaga erishish uchun esa zonddan 0.6mkl solinadi. Taq- polimeraza fermentidan esa 0.1mkl miqdorda solinadi. Hosil bo‘lgan umumiy miqdordan mos ravishda probirkalarga 13.8 mkl dan Matser mix Mutant va Matser mix WT lardan solib, utsiga esa 1.2 mkl dan PZR-mahsulotdan solinadi. Keyin esa Real vaqtdagi (Real-time PZR) PZR-amplifikatorga joylashtiramiz.

Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiyani o‘tkazishda quyidagi datsur yordamida olib boriladi.