Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

3. Хромосомаларни дифференциал бўяш услублари.
Кариотип ҳақида энг тўлиқ тушунчани дифференциал бўялган хромосомалар препаратларида олиш мумкин. Дифференциал бўяш услублари асосий бўялиш турлари – Q, G ва R га мос ҳолда ҳар бир хромосома тўпламини гомологик жуфтлик учун специфик бўлган чизиқли сурат бўйича идентификациялаш имконини беради.
Хромосомаларни G-бўяш услуби (GTG услуби).
Эритмалар

1. 
   Буфер эритма SKN, pH 7,8 (“бевосита” препаратлар учун) ёки GKN, pH 7,8 (ҳужайраларни култивациялаш учун).
   
2. 
   Трипсиннинг 0,25% ли эритмаси. Трипсин SKN буферида эритилади, pH 7,8.
   
3. 
   Гимза бўёғининг 5% ли эритмаси: бўёқнинг 1 мл бош эритмаси SKN нинг 20 мл буферида эритилади.
   

Бўяш техникаси

1. 
   Препаратлар (янги тайёрланган ёки хона ҳароратида 10 кундан ортиқ муддатда сақланган) 100°С ҳароратда 30 дақиқа мобайнида ушлаб турилади.
   
2. 
   Тахминан 30-40°С гача совутилади.
   
3. 
   Трипсин эритмасида 2-5 сония қайта ишланади.
   
4. 
   SKN эритмасида чайилади (10-15 сония), рН 9,0.
   
5. 
   Препаратга 2-3 мл бўёвчи модда томизилиб 5-10 дақиқа бўялади.
   
6. 
   Бўёвчи модда оқиб турган сувда ювилади ва қуритилади.
   

Эслатма

1. 
   Янги тайёрланган буфер эритмасидан фойдаланиш керак.
   
2. 
   Ҳар бир препаратни бўёвчи модданинг янги порцияси билан бўяш мақсадга мувофиқ.
   

4. Флуоресцентли in situ гибридизациялаш (FISH)
Флуоресцентли in situ гибридизациялаш услуби фиксацияланган хромосомалар ва интерфазали ядролар препаратларида хромосома ДНКсининг ДНК(РНК)-зондлари билан турғун гибрид молекулалари ҳосил қилиш қобилиятига асосланган. Ушбу услуб ёрдамида бевосита ҳужайрада, ҳужайра ядросида ёки хромосомаларда ДНК ёки РНК нинг турли кетма-кетлигининг аниқ жойлашишини белгилаш мумкин.
Цитогенетик ташхисотда FISH услубини қўллаш структур хромосомали қайта қурилишларни идентификациялаш, маркерли хромосомалар табиатини аниқлаш, ҳам метафазали, ҳам интерфазали ядроларда хромосома тўплами миқдорий бузилишларини таҳлил қилиш имконини беради. Турли детекция тизимлари ёрдамида аниқланадиган ҳар хил модификацияланган синамалар комбинацияси бир вақтнинг ўзида битта интерфазали ядрода ёки битта метафазали пластинкада иккита ва ундан кўп ДНК кетма-кетлиги жойлашган ўрнини аниқлашга имкон беради.
Ҳозирги вақтда тадқиқотчиларга қулай бўлиши кўзда тутилиб FISH учун зонд ва реактивларнинг коммерцияли тўпламлари ишлаб чиқилган, улар хромосомаларнинг энг кўп учрайдиган миқдорий ва структур абберацияларини ташхислашда қўлланилади.
ДНК-ДНК ноизотоп гибридизациясини in situ бажаришнинг классик схемасига биноан FISH услуби ДНК-зондларни тайёрлаш, препаратларни гибридизациялашдан олдинги қайта ишлаш, гибридизация реакциясини амалга ошириш, гибридизациядан кейинги ювиш, гибрид молекулаларини детекциялаш, бўяш ва препаратларни боғлашни ўз ичига олади.
4.1. ДНК-зондлар
FISH учун ДНК-зондларга бўлган асосий талаблар қуйидагилардир: юқори даражадаги тозаланиш, 50% ва ундан кўп модификацияланган нуклеотидларни қўшиш самарадорлиги, белгиланган фрагментлар ўлчами 150 дан 700 п.н.гача. Юқорида келтирилган кўрсаткичлар гибридизация самарадорлиги ва сигнал:фон нисбатига жиддий тарзда таъсир қилади.
Қуйида ўзини жуда ҳам яхши томондан кўрсатган ник-трансляция реакциясини бажариш усули, шунингдек белгиланган фрагментлар ўлчамларини оптималлаштиришнинг ва зондни белгилаш самарадорлигини баҳолашнинг оддий усуллари келтирилган.
4.1.1. Ник-трансляция услуби билан ДНК-зондларини белгилаш
Бош эритмалар

1. 
   1 М трис. 121,1 г трис 800 мл H₂O да эритилади. Концентрацияланган HCl қўшилган ҳолда рН керакли қийматгача етказилади. Эритма ҳажми 1000 мл гача кўпайтирилади.
   
2. 
   1 М MgCl₂. 203,3 г MgCl₂•6H₂O ни 800 мл H₂O да эритилади ва эритма ҳажми 1 л гача етказилади. Қисмларга ажратилади ва автоклавлаш орқали стрелизацияланади.
   
3. 
   1 М дитиотрейтол (ДТТ). 3,09 г ДТТ ни 20 мл 0,01 М ацетат натрийда эритилади, pH 5,2. Фильтрлаш орқали стерилазацияланади, 1 млдан қисмларга қуйилади ва -20°С да сақланади.
   
4. 
   р-меркаптоэтанол. Одатда 14,4 М эритма кўринишида ишлаб чиқарилади. Тўқ рангли шиша идишларда +4°С да сақланади.
   
5. 
   Натрийнинг 3 М-ацетати. 408,1 г натрий ацетат+3H₂O 800 мл H₂O да эритилади. Музли уксус кислотаси билан рН 5,2 га тўғриланади. Эритма ҳажми 1 л га етказилади. Қисмларга ажратилади ва автоклавлаш орқали стерилланади.
   
6. 
   0,5 М ЭДТА. 800 мл H₂O га 186,1 г ЭДТА•2 H₂O динатрий тузи қўшилади. Магнит аралаштиргичда жадал тарзда аралаштирилади. NaOH (~ 20 г NaOH) ёрдамида рН 8,0 гача етказилади. Эритма ҳажми 1000 мл га тенглаштирилади. Қисмларга қуйиб чиқилади ва автоклавлаш орқали стерилизацияланади.
   

Реакция аралашмаси таркиби

• 
  Ник-трансляция учун 5 мкл 10 x буфер (0,5 М Tris-HCl, pH 7,8; 50 мМ MgCl₂; 0,5мг/мл ҳўкиз зардоби албумини (ҲЗА);
  
• 
  5 мкл 0,1 М дитиотрейтол (ДТТ);
  
• 
  5 мкл 0,1 М р-меркаптоэтанол;
  
• 
  4 мкл нуклеотидлар аралашмаси (0,5 мМ дАТФ; 0,5 мМ дГТФ; 0,5 мМ дЦТФ; 1 мМ дТТФ);
  
• 
  2 мкл 1мМ био-11-дУТФ (ёки диг-11-дУТФ, флуоресцин-12-дУТФ ва бошқ.);
  
• 
  ___ мкл (1мкг) ДНК-синамалар;
  
• 
  ___ мкл (10 ед.) I E.Coli ДНК-полимеразалари;
  
• 
  ___ мкл (ДНКаза I нинг ишчи эритмаси мкл нинг оптимал миқдори*;
  
• 
  ___ мкл охирги ҳажми 50 мкл бўлган бидистилланган сув.
  

* - ДНКаза I нинг бош эритмаси: 1 мг ДНКаза I 0,15 М NaCl ва 50% глицеринли 1 мл буферда эритилади, -20°С да сақланади.


ДНКаза I ишчи эритмаси: бош эритмани 1000 марта эритиш орқали ишчи эритма тайёрланади: бевосита қўллашдан олдини бош эритманинг 1 мкл 1 мл бидистирланган совуқ сувга (+4°C) қўшилади ва аралаштирилади.
Протокол

1. 
   Эппендорфов пробиркасида муз қўлланган ҳолда реакцион аралашма тайёрланади, бунда ферментлар энг охирида қўшилади.
   
2. 
   Пробиркани чайқаш орқали аралашма аралаштирилади ва центрифугалаш орқали тезда чўктирилади.
   
3. 
   Реакцион аралашма +15°С да сув ҳаммомида икки соат ёки +10°C да тўрт соат инкубация қилинади.
   
4. 
   Реакция рН 8,0 5 мкл 0,5 М ЭДТА қўшиш билан тўхтатилади. Агар 3-пунктдан кейин тўхтовсиз 5-пунктга ўтилса ушбу пунктни бажариш шарт эмас.
   
5. 
   Реакцион аралашмага ДНК-ташувчи эритма (50 мкг) қўшилади*, кейин рН 5,5 бўлган 3 М натрий ацетати 1/10 ҳажмда ва -20°С гача совутилган 96% этанол 3-5 ҳажмда қўшилади.
   
6. 
   Аралашмани 30 дақиқадан кам бўлмаган вақт ичида - 70°С да ёки -20°С да 3 соат ушлаб турилади. -20°С да аралашмани тунга ёки анча узоқ вақтга қолдириш мумкин.
   
7. 
   ДНК 15 минг айланиш/дақ тезликда 15-20 дақиқа мобайнида центрифугалаш билан чўктирилади (совутилган центрифугани ишлатиш маъқулроқ, +4°С).
   
8. 
   Чўкма усти суюқлиги эҳтиёткорлик билан олиб ташланади.
   
9. 
   Чўкмага -20°С гача совутилган 70% ли этанол қўшилади, пробирка ағдарилмасдан секинлик билан чайқатилади, ва 15 минг айланиш/дақ да 10 дақиқа мобайнида центрифугаланади.
   
10. 
    Пипетка билан чўкма усти суюқлиги олиб ташланади ва чўкма +37°С да қуритилади. Қуриган чўкма шаффоф бўлиб қолади.
    
11. 
    ДНК 40 мкл бидистирланган сувда эритилади. Белгиланган ДНК нинг олинган охирги концентрацияси 20-25 нг/ мкл ни ташкил этади.
    
12. 
    Тайёрланган нишонланган ДНК эритмасини -20°С да бир неча ой давомида сақлаш мумкин.
    

* – ДНК-ташувчи сифатида лосос спермасининг фрагментланган ДНК сини қўллаш мумкин (фрагментлар ўлчами 400 дан 1000 п.н. гача).