Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

4.1.2. Маркерланган фрагментлар ўлчамларини оптималлаштириш
Протокол

1. 
   Ник-трансляция учун реакцион аралашма тайёрланади (Протокол 4.1.1 нинг 1-2 п. қаранг), уларга ДНКаза 1 нинг ишчи эритмаси турли – 1; 2,5; 5 ва 10 мкл ҳажмлари қўшилади.
   
2. 
   Протокол 4.1.1 нинг 3 пунктида баён этилган йўл билан реакция амалга оширилади.
   
3. 
   Ҳар бир пробиркадан 10 мкл (200 нг) аликвота ажратиб олиниб янги пробиркаларга солинади, реакция ўтказилган пробиркалар эса тестлаш вақтида совутгичга қўйилади – ҳарорат +4°С дан баланд бўлмаслиги керак.
   
4. 
   Пробиркаларни қайнаб турган сувли ҳаммомга 5 дақиқага солиниб ДНК денатурланади.
   
5. 
   Пробиркалар дарҳол музга ўтказилади. 2-3 дақиқадан кейин пробиркаларга 25% фиколл, 0,25% ксиленцианол, 0,25% бромфенолли кўк тутган эритма 1/10 миқдорда солинади.
   
6. 
   Намуналар тезлик билан ДНК ўлчамлари (ўлчамлар 50 дан 2000 гача) маркерлари билан бирга 2% ли агарли гелга суртилади ва бромфенолли кўк гелнинг 2/3 қисмига ўтмагунча электрофорез қилинади. ДНК молекулалари ренатурациясининг олдини олиш учун электрофорез токнинг қуввати 40-60 В ва кучи 25-30 А бўлганда, совуқ жойда бажарилиши керак.
   
7. 
   Гел бромли этидийнинг сувли эритмаси (0,5 мкг/л) билан ювилади ва ўтувчи УФ-нурда таҳлил этилади. ДНК ўлчамлари ва ДНК маркерлари ўлчалмари солиштирилади. Зондларнинг оптимал ўлчами 150-700 нуклеотидларни ташкил қилади.
   
8. 
   Фрагментлар ўлчами оптимал бўлган пробиркаларда ДНК-зондларни нишонлашни тугатиш (Протокол 4.1.1 нинг 5-12 п қаранг).
   

4.1.3. ДНК-зондни нишонлаш самарадорлигини баҳолаш
Эритмалар

1. 
   эритма 20xSSC, pH 7,0 — 3 М NaCl, 0,3 М цитрат Na;
   
2. 
   эритма 4xSSC, pH 7,0 — 200 мл 20xSSC эритмасига 800 мл дистиллирланган сувни қўшиш;
   
3. 
   чайиш учун эритмалар — 4xSSC, 0,2%-й Tween-20;
   
4. 
   блокловчи эритма — 1% блокловчи реагент (Boehringer Mannheim), 4xSSC, 0,2%-й Tween-20. Блокловчи реагентни БСА (3%) ёки ёғсизлантирилган қуруқ сут (5%) билан алмаштириш мумкин;
   
5. 
   инкубацион эритма — 1% ли блокловчи реагент (Boehringer Mannheim), 4xSSC, 0,1%-й Tween-20. Блокловчи реагентни БСА (1%) ёки конъюгант стрептавидин (авидин)-ишқорий фосфатаза сақловчи ёғсизлантирилган қуруқ сут билан ишлаб чифарувчи фирма тавсиясига мос ҳолда алмаштириш мумкин.
   
6. 
   Ишқорий фосфатаза учун эритма — 0,1 М Tris-HCl, pH 9,5; 0,1 М NaCl; 10 мМ MgCl₂.
   
7. 
   Детекция учун эритма — NBT ва BCIP субстратларини тутувчи ишқорий фосфатаза учун эритма. Ишқорий фосфатазага мўлжалланган 10 мл буферга NBT нинг 45 мкл бош эритмасини ва BCIPК нинг 35 мкл бош эритмасини қўшамиз.
   
8. 
   NBT нинг бош эритмаси (нитротетразол кўки) — 75 мг/мл диметилформамидда.
   
9. 
   BCIP бош эритмаси (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат) — 50 мг/мл 50% ли диметилформамидда (BCIP нинг калийли тузи ишлатилганда) ёки сувда (BCIP нинг натрийли тузи ишлатилганда).
   

Протокол

1. 
   Иммунологик планшет чуқурчаларида ёки парафилмда ДНК-зонднинг 1 нг/мкл дан 0,1 пг/мкл гача бўлган эритмаларини тайёрлаш. Бунинг учун иммунологик планшет чуқурчаларига ёки парафилмга 9 мкл дан, биринчи эритмага 9,5 мкл, дистилланган сув солинади; биринчи томчига 0,5 мкл бош зонд эритмаси қўшилади (Протокол 4.1.1 нинг 11-п. қаранг), Пипетка билан эҳтиёткорлик билан аралаштирилади; кейин биринчи томчидан 1 мкл иккинчи томчига ўтказилади ва ҳ.
   
2. 
   Ҳар бир эритмадан 1 мкл нейлон мембранага қўйилади ва қуритилади.
   
3. 
   Мембрана УФ-трансиллюминаторда 2-3 дақиқада нурлантирилади.
   
4. 
   Мембрана пластик кювета ёки Петри чашкасига жойлаштирилади ва блокловчи эритма қўйилади, 37°С да 15 дақиқа инкубация қилинади.
   
5. 
   Эритмани эҳтиёткорлик билан слить ва инкубацион эритмани кюветага қўйинг. Ишлаб чиқарувчи тавсияларига кўра 37°С да инкубация қилинг.
   
6. 
   Инкубацион эритмани тўкиб ташланг ва кюветани чайқатиб филтрни ювиш учун мўлжалланган эритмаларни уч марта алмаштирган ҳолда ювинг, ҳар бирида 5 дақиқадан, ювиш ҳарорати инкубацион ҳароратдан 2°С баланд бўлиши керак.
   
7. 
   Филтрни хона ҳароратида ишқорий фосфатаза эритмасида 5 дақиқа инкубация қилинг.
   
8. 
   Эритмани тўкиб ташланг ва филтрни детекция эритмасида хона ҳароратида аниқ кўк рангдаги нуқталар пайдо бўлганча инкубацияланг. Бўялиш вақти 15 дақиқадан 3 соатгача ўзгариб туриши мумкин.
   
9. 
   Филтрни дистилланган сувда ювинг ва қуритинг.
   
10. 
    ДНК-зондни, агар унинг 1 пг си ушбу тест ёрдамида аниқланса, гибридизация учун ишлатиш мумкин, лекин ДНК нинг юқори қайталаниш кетма-кетлиги вазиятида (сателлит ва алфоид қайталанишлар) 5 пг нинг аниқланиши етарли ҳисобланади.
    

4.2. Хромосома ва интерфазали ядролар препаратларини тайёрлаш

Гибридизацияни in situ бажариш учун ҳар қайси тўқима ва аъзолар ҳужайраларининг стандарт методика бўйича тайёрланган цитологик ёки гистологик препаратлари ярайди. Клиник цитогенетик лаборатория шароитларида цитотрофобласт хорионал эпителийси ҳужайралари, периферик қон лимфоцитларининг култивацияланган препаратлари, амниотик суюқликнинг култивацияланган ва култивацияланмаган ҳужайралари, аборт материалидан олинган турли тўқималар, ҳамда лунж эпителийси ва қон ҳужайралари ишлатилади.
Култивацияланган лимфоцитлар ва бошқа ҳужайраларнинг хромосома ва интерфазали ядролар препаратларини тайёрлаш, шунингдек турли тўқималар ҳужайралари хромосомаларнинг ва интерфазали ядроларнинг бевосита препаратларини тайёрлаш техникаси юқорида баён этилган.
Бу бўлимда биз бошқа типдаги ҳужайралардан препаратлар тайёрлаш методикасини келтирамиз.