Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

Кариотиплашни амалга ошириш учун хромосомалар препаратларини тайёрлаш, уларни фиксациялаш ва бўяш протоколлари
1. Периферик қон лимфоцитларидан хромосома препаратларини тайёрлаш.
Клиник цитогенетикада энг оддий ва содда, шу сабабли кенг тарқалган усул бўлиб периферик қон лимфоцитларидан олинган хромосомаларни таҳлил қилиш ҳисобланади. Қон оқимида айланиб юрувчи ҳужайралар меъёрда пролиферацияга учрамайди, лекин културал шароитларда митогенлар (фитогемагглютинин (ФГА), покивид, конканавалин А ва б.) лимфоцитларнинг митотик бўлинишини стимуллайди. Микро услубда тоза капилляр қон (бармоқ ёки товондан олинган), ярим микро услубда ва макро услубда – веноз қон ёки унинг лейкоцитар фракцияси ишлатилади. Ҳар бир ҳолатда, қон олинаётганда стерил шароитларга жиддий амал қилиш керак.
Реактивлар
Гепарин (25 000 бирл.); ўстириш муҳити (RPMI 1640 ёки Игла); антибиотиклар (пенициллин — 100 бирл/мл + канамицин — 100 мкг/мл, ёки гентамицин — 50 мкг/мл); L-глутамин (охирги концентрация 0,2 мг/мл); зардоб (сигир эмбрионлариники); фитогемагглютинин, колхицин (колцемид).
1. Ўзида 100-500 бирл. гепарин тутган стерил шприцга периферик венадан 1-3 мл қон олинади ва аралаштирилади.
2. Пенициллин флаконларига антибиотик ва глутамин тутган 4,25-4,5 мл муҳит; 0,75-0,5 мл зардоб; 0,3-0,5 мл гепаринизацияланган қон; ишлаб чиқарувчи фирма тавсия этган концентрацияларда ФГА қўшилади. Ёпиқ тизимда +37°С ҳароратда ўстиришнинг стандарт вақти 72 соат. Эҳтиёткорлик билан чайқатилиб ўстириш муҳитлари ҳар куни аралаштирилиб турилади.
3. Ўстиришнинг 71 соатида, яъни фиксация бошланишидан 50-60 дақиқа олдин ўстириш муҳитига колхицин (колцемид) 0,15-8,0 мкг/мл ҳажмдаги охирги дозаси киритилади.
4. Флакондаги таркиб центрифугали пробиркаларга солинади ва 1000 айл/дақиқа тезликда 10 дақиқа центрифугалаш орқали ҳужайралар чўктирилади, чўкма устида 0,3-0,5 мл қолдирилган ҳолда супернатант пипетка билан олиб ташланади. Чўкма кучли чайқаш орқали тарқатилади ва гипотоник эритма (0,55% KCl эритмаси ёки 1% ли уч алмаштирилган Na цитрати ва 0,55% KCl, 1:1)нинг 8-10 мл қўшилади, пипеткалаш орқали аралаштирилади ва 37°С да 15-20 дақиқа инкубацияланади.
5. Фиксация. Центрифугаланади (10 дақиқа, 1000 айл/дақ). Чўкма 0,5 мл чўкма усти суюқлигида пухталик билан аралаштирилади. Чўкмага янги тайёрланган фиксатор (этанол+муз уксус кислотаси, 3:1) оқим билан қуйилади ва пипеткалаш орқали аралаштирилади. Биринчи фиксация +4°С остида 30 дақиқа мобайнида олиб борилади. Кейин фиксатор 5-7 мл порция қўшилган ҳолда 3-5 марта алмаштирилади.
6. Препаратларни тайёрлаш.
Суспензияни қўйиш совуқ камерада ёки совуқ сувда совутилган предмет ойналарига 30-50 см баландликдан 30-50 мкл дан томчилаб тушириш орқали амалга оширилади. Ойналар хона ҳароратида қуритилади. Препаратларда хромосомалар ёмон сочилганда ойналарни спиртовка оловининг устида ёки фиксаторни куйдириш орқали қуритиш тавсия этилади.
2. Хромосомаларни бўяшнинг эскирган усули
Хромосомаларни яхлит, ёки бир текис бўяш эскирган усул номини олган. Бу услуб хромосомаларни метафазали пластинкаларда санаш, уларни гуруҳлар бўйича идентификациялаш, баъзи хромосомали аберациялар типларини қайд қилиш имконини беради.
1. Препаратлар стандарт фосфат буферда хона ҳароратида 5-15 дақиқа мобайнида бўёқ тутган бюксда ёки препаратга 2-5 мл бўёвчи эритма қўшиш орқали Гимза бўёғининг 3-5% ли эритмаси билан бўялади.
2. Оқаётган сувда ювиш ва қуритиш.