Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

Эслатма. Препаратларни ювишнинг барча муолажалари сувли ҳаммом-бешикда махсус стакан ёки кюветаларда олиб бориш тавсия этилади.

4.4. in situ гибридизациялаш

ДНК-зонд молекулаларини ДНК-нишон (хромосомали ДНК)дан гибридизациялашнинг ўзига хос хусусияти гибридизацион аралашма таркиби ва ҳарорат тартибига боғлиқ. Шунинг учун текширилаётган ДНКнинг нуклеотид таркиби ва нусхалар сони кетма-кетлигига, шунингдек тадқиқот олдига қўйилган вазифаларга боғлиқ ҳолда қуйидагилар ўзгариши мумкин: гибридизацияланган аралашма таркиби (баъзи компонентлар – декстран сулфат, ионсиз детергентлар ва ҳк. ни қўшиш ёки истисно тариқасида), денатурацияловчи реагент таркиби – формамид (0% дан 60% гача) ёки тузли буферлар миқдори (2 дан 0,1xSSC гача), гибридизация бажарилиши ҳарорат тартиби (+37 дан +42°С гача).


4.4.1. Юқори (ўртамиёна) даражадаги қайталаниш кетма-кетлиги ва кўп сондаги интерсперс қайталанишни сақламайдиган кетма-кетликнинг уникаллигига эга ДНК-зондлар билан in situ гибридизациялаш.
Эритмалар
Сателлит ва алфоид қайталанишларни гибридизациялаш учун гибридизацион эритма таркиби* (формамиднинг охирги концентрацияси 55%):
10 мкл — умумий ҳажм
7 мкл — №1 гибридизацион буфер

• 
  _____мкл — ДНК-зонд (10-30 нг)
  
• 
  _____мкл — ДНК-ташувчи (ДНК-зонд билан солиштирганда 20-50-карра ортиқча)
  
• 
  _____мкл дистилланган сув 10 мкл гача.
  

* – ушбу эритмада +37°С ҳароратда гибридизацияни амалга ошириш алоҳида хромосомалар қисмларига махсус бўлган ДНК нинг алфоид кетма-кетликларини (алфоид ДНК нинг гомологик қисмларига эга 13- ва 21-, 14- ва 22-хромосомалар бундан мустасно) аниқлашга имкон берувчи ўртача қаттиқлик шартларига мос келади.

1. 
   Ўртамиёна қайталанишларни гибридизациялаш учун гибридизацион эритма таркиби (формамиднинг охирги концентрацияси 50 %):
   

10 мкл — умумий ҳажм

• 
  7 мкл — №2 гибридизацион буфер
  
• 
  _____мкл — ДНК-зонд (20-40 нг)
  
• 
  _____мкл — ДНК-ташувчи (ДНК-зондга солиштирганда 50 карра ортиқ)
  
• 
  _____мкл дистилланган сув 10 мкл гача.
  

2. 
   Уникал кетма-кетликларни гибридизациялаш учун гибридизацион эритма таркиби (формамиднинг охирги концентрацияси 50 %):
   

10 мкл — умумий ҳажм

• 
  7 мкл — №2 гибридизацион буфер
  
• 
  _____мкл — ДНК-зонд (100-200 нг)
  
• 
  _____мкл — ДНК-ташувчи (ДНК-зондга солиштирганда 500 карра ортиқ)
  
• 
  _____мкл дистилланган сув 10 мкл гача.
  

Гибридизацион буфер эритмаларни тайёрлаш

№1 буфер — пробиркада 10 г декстран сульфата, 1мл 20xSSC, 5,5 мл деионизацияланган формамидни аралаштириш ва бидистилланган сув билан эритма ҳажмини 7 мл гача етказиш; аралашмани +40°С да шейкерда эритиш; тешиклар ўлчамлари 45 мкм бўлган филтр орқали филтрлаш. Тайёр бўлган буферни –20°С да сақлаш.
№2 буфер — тайёрлаш ва таркиби худди №1 буфердагидек, фақат формамид ҳажми 5 мл.
Протокол

1. 
   Эппендорфов пробиркасида нишонланган синама (синамалар) эритмаларини ва ДНК-ташувчини +37°С гача иситилган гибридизацион буфер билан аралаштириб гибридизацион эритмани тайёрлаш.
   
2. 
   Гибридизацион эритма тутган пробиркани қайнаб турган ҳаммомга 5-10 дақиқага қўйиб синамани денатурациялаш.
   
3. 
   Тезда пробиркани музга қўйиш. Денатурацияланган зондни музда 30 дақиқадан кўп вақтга қўйиш тавсия этилмайди.
   
4. 
   Гибридизацион эритма олдиндан 37-38°С гача иситилган препаратларга 22х22 мм ли қполовчи ойналар остига 10 мкл дан солиш ва қопловчи ойналар периметри бўйлаб резина клей билан елимлаш. Олдиндан +37-38°С гача иситилган нам камерага препаратларни жойлаштириш.
   
5. 
   Препаратларни +37-38°С да 12-18 соат (тунда) инкубациялаш.
   

Эслатма

1. 
   агар тадқиқот мақсади бир вақтнинг ўзида икки ва ундан кўп ДНК кетма-кетлигини аниқлаш бўлса, гибридизацион эритмага бир вақтнинг ўзида турлича модификацияланган нуклеотидлар билан нишонланган бир нечта синамаларни қўшиш керак. Бунда ДНК-ташувчи концентрациясини пропорционал равишда ошириш лозим.
   
2. 
   агар бош синама ва ДНК-ташувчи умумий ҳажми гибридизацион эритма ҳажмидан 30% га кўп бўлса, унда уларнинг биттаси ёки иккаласи (бош синама ва ДНК-ташувчи)ни ҳам лиофил қуритгичда ёки термостатда +37°С да қуритиш керак.
   

4.4.2. Препаратларни гибридизациядан кейин ювиш
Гибридизациядан кейин ювиш препаратлардан хромосома ДНКси билан боғланган ДНК-зонд молекулаларини олиб ташлаш учун зарурдир. Ушбу босқични аниқ бажариш ташхисотнинг умумий натижасига таъсир қилади, сабаби носпецифик “фонли” гибридизация FISH дан кейин препаратларни корректли таҳлил қилишни қийинлаштиради, баъзида эса бажаришга ҳам имконият бермайди. Хромосомаларда ёки интерфазали ядроларда ДНК-зонддаги кетма-кетликка гомологик кетма-кетликни аниқлаш мақсадида ювишларни худди гибридизациядаги формамид концентарциялари билан амалга оширилади, ҳарорат эса гибридизациядаги ҳароратдан 5°С га баланд бўлиши керак.
Протокол

1. 
   Эҳтиёткорлик билан резина елим олиб ташланади.
   
2. 
   Препаратларни 50% (55%)ли формамид — 2xSSC, pH 7,0 эритмасини тутган стаканга солинади (+43°С). 3-5 дақиқадан сўнг қопловчи ойналар пухталик билан олинади.
   
3. 
   Препаратлар формамид 50% (55%) — 2xSSC pH 7.0 эритмасида, эритмани уч марта алмаштирган ҳолда, ҳар бирида 5 дақиқадан, +43°С ҳароратда ювилади.
   
4. 
   Препаратлар 2xSSC эритмасида, эритмани уч марта алмаштирган ҳолда, ҳар бирида 5 дақиқадан +43°С ҳароратда ювилади.
   
5. 
   Препаратлар 0,2xSSC эритмасида 5 дақиқа мобайнида +43°С ҳарорат остида ювилади.
   

Эслатма

1. 
   ювиш учун формамид эритмаси гибридизацияда ишлатилган концентрацияларда қўлланилади. Формамидни деионсизлантириш шарт эмас, зарурат бўлса рН концентрирланган HCl билан 7,0 гача олиб борилади.
   
2. 
   ювишни сувли ҳаммом-бешикда стакан ёки махсус кюветаларда олиб бориш тавсия этилади.