Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

4.5. Гибрид молекулаларини флуоресцентли детекциялаш
Гибрид молекулаларини турли рангдаги флурохром-детекторлар қўллаган ҳолда ҳар хил иммункимёвий детекция тизимлари ёрдамида аниқлаш мумкин, бу битта ҳужайрада бир вақтнинг ўзида ДНКнинг бир нечта кетма-кетлигини аниқлаш имконини яратади. Қуйида биотин билан маркерланган ДНК-зондни in situ гибридизациядан кейин гибрид молекулаларни “бир хил рангда” детекциялаш услуби келтирилган.
Эритмалар

1. 
   Эритма 4xSSC, pH 7,0 — 200 мл 20xSSC эритмасига 800 мл дистилланган сув қўшилади.
   
2. 
   Ювиш учун эритмалар — 4xSSC, 0,2 %-й Tween-20.
   
3. 
   Блокловчи эритма — 1% ли блокловчи реагент (Boehringer Mannheim), 4x SSC, 0,1%-й Tween-20. Блокловчи реагентни БСА (3%) ёки ёғсизлантирилган қуруқ сут (5%) билан алмаштириш мумкин.
   
4. 
   Детекция учун эритма— 1% ли блокловчи реагент (Boehringer Mannheim) 4xSSC, 0,1%-й Tween-20. Блокловчи реагентни БСА (3%) ёки мос конъюгат-детектор тутган ёғсизлантирилган қуруқ сут (5%) билан алмаштириш мумкин. Эритмани қўлланишдан 20-30 дақиқа олдин эппендорф пробиркасида тайёрлаш, яхшилаб аралаштириб хона ҳароратида қоронғи жойда қолдириш керак, ишлатишдан олдин яна бир марта аралаштириб тезда центрифугалаш орқали чўктириш зарур.
   

Протокол

1. 
   0,2xSSC эритмасидаги препаратларни олиб, улардан суюқликниқоқиб ташлаб иситувчи столикга жойлаштирамиз.
   
2. 
   Препаратларга 150 мкл блокловчи эритма солинади ва 24х50 мм ли қопловчи ойна билан ёпилади (бошқа ўлчамдаги ойна ишлатилганда солинадиган эритма ҳажми мос равишда ўзгартирилади).
   
3. 
   Препаратлар нам камерада +37°С да 20-30 дақиқа инкубацияланади.
   
4. 
   Эҳтиёткорлик билан (силкитилиб) қопловчи ойналар олиб ташланади.
   
5. 
   Нам препаратлар дарҳол +37°С га иситилган нам камерага ёки шу ҳароратгача иситилган столикга қўйилади ва препаратларга авидин-FITC конъюгатини 5 мкг/мл концентрацияда тутган детекция учун мўлжалланган эритма 80-100 мкл ҳажмда солинади, устидан 24х50 мм ли қопловчи ойна билан ёпилади. Препаратлар термостатнинг нам камерасида +37°С да 30-40 дақиқа давомида инкубацияланади.
   
6. 
   Қопловчи ойналар эҳтиёткорлик билан олиб ташланади, чайқатилган ҳолда ювиш учун мўлжалланган суюқликларда, ҳар бирида 5 дақиқада уч марта алмаштирилган ҳолда +43°С да ювилади.
   
7. 
   Препаратлар тезлик билан нам камерага ёки иситувчи столикга ўтказилади ва уларга биотинилланган антиавидин D ни 5 мкг/мл концентрацияда тутган детекция учун мўлжалланган 80-100 мкл эритма солинади, 24х50 мм ли қопловчи ойна билан ёпилади. Препаратлар нам камерада +37°С да термостатда 30-40 дақиқа инкубацияланади.
   
8. 
   Ушбу протоколнинг 6-пунктини қайтаринг.
   
9. 
   Ушбу Протоколнинг 5-пунктини қайтаринг. Инкубация давомийлигини 20-25 дақиқага камайтириш мумкин.
   
10. 
    Ушбу протоколнинг 6-пунктини қайтаринг.
    
11. 
    Препаратлар 14xSSC, 0,1%-й Tween-20PBS солинган стаканда, кейин дистилланган сув тутган стаканда чайилади. Фақат дистилланган сувни ҳам қўлласа бўлади – икки марта шарти билан.
    
12. 
    Препаратларни спиртлар сериясида (70 %, 80 %, 96 % этанол) ҳар бирида 5 дақиқадан дегидратцияланади.
    
13. 
    Препаратлар ҳавода қуритилади.
    

Эслатма

1. 
   Препаратларни ювиш муолажаларининг барчасини сувли ҳаммом-бешикда махсус стакан ёки кюветаларда амалга ошириш тавсия этилади.
   
2. 
   Детекциянинг барча босқичларини бажаришда препратларнинг юзалари қуриб қолмаслиги керак.
   
3. 
   5-босқичдан бошлаб барча босқичлар қоронғилаштирилган хонада амалга оширилиш керак. Ёруғ хонада ишлаш қатъий ман қилинади.
   
4. 
   Агар гибридизацион сигналларни кучайтириш (масалан, зонд сифатида ДНК нинг сателлит кетма-кетлигини ишлатиш) зарурати бўлмаса, флуоресцент сигналларни иммунокимёвий амплификация босқичлар (7-9-босқичлар)ни бажармаса бўлади. 6-пунктдан ейин 11-13 пунктларни бажаришга ўтилади.