Таълим вазирлиги мирзо улуғбек номидаги ўзбекистон миллий университети

2.3. Тажрибаларга тайёрлаш техникаси

Ҳайвонлар эрталаб соат 8-10 оралиғида овқат берилмасдан декапитация усулида жонсизлантирилади. Жонсизлантирилган ҳайвонларнинг қорин қисми зудлик билан очилиб ошқозон ости бези, ингичка ичаги ажратилиб музли сув тўлдирилган идиш устидаги ойнага қўйилади ва тажрибалар учун ишлатилади.

2.4. Ошқозон ости бези ва ичак гомогенатларини тайёрлаш

Тажрибалар жараёнида музли ойна устида ошқозон ости бези ошқозондан ва ёғ тўқималаридан тезлик билан ажратиб олиниб массаси электрон тарози билан ўлчанди ва пробиркаларга солиниб музли сув ичига қўйилди. Ингичка ичак тутқичдан ажратиб олиниб унинг бўшлиғи 20-30 мл совутилган Рингер эритмаси (рН-7,4) билан ювилди ва массаси электрон тарози ёрдамида ўлчанди. Сўнгра ингичка ичак музли ойна устига қўйилиб ўн икки бармоқли ичак ва проксимо-дистал қисимларга ажратиб олинди. Ошқозон ости бези ва ичак мукозаси 1/10 нисбатда совитилган Рингер эритмаси билан аралаштирилиб, 1-1,5 минут давомида тефлонли гомогенизатор ёрдамида гомогенизация қилинди.

2.5. Ферментатив фаолликни аниқлаш

Альфа-амилаза фаоллиги А.М.Уголевнинг (70) методи бўйича аниқланди. Бу услуб крахмал парчаланишини Смит-Роэнинг йодли реактиви иштирокида фотоколориметрик услубда аниқлашга асосланган. Субстрат сифатида эрувчан крахмалнинг 200 мг% ли эритмасидан фойдаланилди. Иш қуйидаги тартибда олиб борилди. Рингер эритмаси қўшилган ошқозон ости безидан гомогенизатор асбоби ёрдамида эзилма тайёрланди. 0,2 % ли крахмал эритмасидан 3 млдан пробиркаларга солинди ва 1:5000 нисбатда тайёрланган ошқозон ости бези эзилмасидан 1 мл солиниб, фермент фаоллиги рўёбга чиқиши учун 15 дақиқа давомида 37-38⁰С даги сув ҳаммомига инкубация учун қўйилди ва инкубатдан 1 мл олиб 3 мл Смит-Роэ эритмасига солинди. Ҳосил бўлган рангли эритмани фотоэлектроколориметр ёрдамида оптик сиғими 620 нм узунликда аниқланди. α-Амилазанинг специфик фаоллиги 1 минут давомида парчаланган крахмалнинг 1 мг миқдорини баъзида 1 г тўқимага, баъзида 1 мг оқсилга нисбатан хисобланди. Ферментнинг умумий фаоллиги эса 1 мин. давомида парчаланган крахмалнинг 1мг миқдорига нисбатан тўқиманинг умумий ўғирлиғига нисбатан хисобланди.
Ингичка ичакдаги сахараза (КФ.3.2.1.48), мальтаза (КФ 3.2.1.20) ва лактаза (КФ.3.2.1.23), фаоллиги Dalhqvist (102) методи бўйича сахароза, мальтоза ва лактоза парчаланишидан хосил бўлган глюкоза миқдорини аниқлашга асосланган. Глюкоза глюкозооксидаза ферменти иштирокида молекула ҳолидаги кислород билан оксидланади ва водород переоксидини (H₂O₂) ҳосил қилади. Бу ўз навбатида переоксидаза ферменти ёрдамида парчаланади ва атом ҳолидаги кислородни ҳосил қилади. Атом ҳолидаги кислород О-дианизидиннинг ўзгариши (яъни қизил рангли бирикманинг ҳосил бўлиши)га олиб келади. Бу бирикманинг оптик зичлиги фотометр КФК-3 ёрдамида ўлчанди. Бўёқнинг интенсивлиги глюкозанинг миқдори билан бевосита боғлиқ. Лактаза, сахараза ва мальтазанинг фаоллиги бир дақиқалик инкубацияда ҳосил бўлган глюкозанинг миқдори (мкмоль) билан ифодаланди.
Бу тажрибада ҳам юқоридаги тартибдагидек ичак эзилмасидан фойдаланилди. Гомогенизатор ёрдамида ичак шиллиқ қаватидан гомогенат тайёрланди. 1:25 нисбатдаги ичак эзилмасидан лактаза ва сахараза ферментларини аниқлаш учун фойдаланилди, мальтаза ферменти учун 1:125 нисбатда ичак эзилмаси олинди. 2 % ли лактоза, саҳароза ва мальтоза эритмаси 0,1 млдан алоҳида пробиркаларга солинди ва пробиркалардаги эритма устига 0,1 млдан ичак эзилмаси солиниб, ферментлар фаоллиги рўёбга чиқиши учун 30 дақиқа давомида 37-38⁰С даги тебранувчи сув ҳаммомли термостатга инкубация учун қўйилди ва ҳосил бўлган глюкоза “Ниҳол” фирмасининг глюкозооксидаза услубига асосланган “Глюко-Фен” йиғмасидан тайёрланган ишчи эритма ёрдамида аниқланди. Ишчи эритма инкубатга 1 мл дан солинди, хона шароитида 30 дақиқага қўйилди. Ҳосил бўлган рангли эритмани фотоэлектроколориметр ёрдамида оптик сиғими 520 нм узунликда аниқланди.
Сахараза, малтаза ва лактазаларнинг фаоллиги 1 минут давомида ҳосил бўлган парчаланиш махсулотининг 1 мкМ миқдорига нисбатан 1 мг оқсилга (специфик фаоллик) ва умумий оқсил миқдорига (умумий фаоллик) ҳисобланди.