Muhandislik qilingan oqsil-oqsil kompleksining strukturasini aniqlash va termodinamik stabilizatsiyasi

9.3-rasm Z va ning CD spektrlari
ko'rsatilgandek beshta Z sistein mutantlari.
210
220
250
230
-20 000
0
-10 000
200
200
10000
240
ZSPA-1 bilan solishtirganda ko'proq va o'tkir rezonanslar bilan mahalliy barqarorlashuvni taklif qiladi
.
B
A
ÿCp° ochilishini aniqlash mumkin emas, chunki 10 ºC da sodir bo'lgan termal ochilish . The
Erish egri chiziqlari ochiladigan muvozanatni aniqlash uchun ishlatilgan (IVda ko'rsatilgan ma'lumotlar). The
oksidlangan mutant ZSPA-1 ga nisbatan Tm ning 12 ºC ga oshishini ko'rsatadi, ammo u hali ham sezilarli.
Tm~79 ºC bilan Z-domenidan pastroq (ma'lumotlar II da ko'rsatilgan).
holat (erigan globul holati). Kamaytirilgan protein chiziqning kengayishini va pastligini ko'rsatadi
yomon qadoqlangan yoki qisman ochilmagan konformatsiyalarni ko'rsatadigan dispersiya (IVda ko'rsatilgan ma'lumotlar).
erish harorati va o'tishning o'rta nuqtasida ochiladigan entalpiya (van't Hoff).
50
15N-HSQC NMR spektri mutantlarning bir xilligi va vodorod bog'lanish barqarorligini kuzatish uchun
ishlatilgan. 3: F5C/S39C mutantining oksidlangan holati uchun 15N - HSQC spektri yaxshilandi.
Oksidlangan holat uchun ÿH° ochilishi (Tm) ni aniqlash mumkin, lekin ochiladigan issiqlik sig'imi
[th]
(deg
c
m
2
dm
ol-1 )
[th
]
(de
g
c
m2

dmol-1
 )
Machine Translated by Google

---

Z:ZSPA-1 kompleksining termodinamik stabilizatsiyasi
ZSPA-1 ga nisbatan (-190 ± 30 kal/mol, K -400 ± 30 kal/mol, K ga nisbatan) (9.4-rasm). The
erish harorati 70 ºC dan yuqori bo'lgan termostabil mutant, ammo bu olib kelmaydi
bog'liq buklanish-ochilish muvozanati. Kutilganidek, bu ZSPA-1 uchun aniqroqdir
1 va 2 spirallarni kovalent tarzda barqarorlashtiradi, chunki ular bog'lovchi sirtni ifodalaydi. Bitta sistein ko'prigi
bog'lovchi entalpiya, ÿH°ITC va bog'lanish doimiysi Kd
bog'lanishdan oldin yaxshiroq qadoqlangan protein, bu yuqorida aytib o'tilgan boshqa natijalarga mos keladi.
2004) yuqorida muhokama qilingan bo'lib, termal ochilishning ta'siri kam ta'sir qiladi.
bog'lanish xususiyatlari haqida ma'lumot (9.1-jadvalga qarang). ning haroratga bog'liqligi
Boshqa sistein mutatsiyalarining ta'siri har xil, ammo hech biri mutant 3 bilan taqqoslanmaydi
konformatsiyani barqarorlashtirishni taklif qiladi (IVda ko'rsatilgan ma'lumotlar). Mutantdagi sistein ko'prigi
Bog'lanish termodinamiÿi ham oksidlovchi, ham qaytaruvchi sharoitlarda tavsiflangan
oksidlanish sharoitlari kichik. Mutant 3 ning bog'lanish yaqinligi a dan ortiq oshdi
farq ikkita oqsil uchun ochiq sirt maydonining o'zgarishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin
bog'lovchi entropiyaga emas, balki ZSPA-1 ga nisbatan bog'lanish entalpiyasining oshishi . Qo'shimcha
bog'lovchi muvozanatdan keladigan hissani ajratib bo'lmaydi
yaqinlikni yaxshilash. Barcha mutantlarni solishtirganda, ular o'rtasida hech qanday bog'liqlik ko'rinmaydi
5:N21C/A56C mutantida taqdim etildi, bu spiral 2ni spiral 3 bilan bog'laydi. Bu eng ko'p
kamaytirilgan holat uchun amalga oshirib bo'lmadi, chunki yomon termal barqarorlik oldini oldi
yuqorida aytib o'tilganidek, uning past termal barqarorligi. Mutant 3 uchun ÿC°p,bog'lanish (oksidlangan) pastroq
tuzatilmagan entalpiya zaif chiziqli emas, lekin haroratni tuzatishdan keyin chiziqli bo'ladi
yuqorida aytib o'tilganidek, tuzatildi. Bu
bog'lanish yaqinligi (9.1-jadval). Sistein ko'priklarini joriy etish birinchi navbatda tanlangan
51
ITC tajribasida termal ochilish-katlama hissasi, ning kalorimetrik qiymatlari
ko'proq olish uchun 10 dan 30 ºC gacha bo'lgan turli haroratlarda tajribalar o'tkazildi
bog'lovchi termodinamika. Mutant 5 ning HSQC spektri ZSPA-1 ga nisbatan yaxshilangan
ITC tomonidan va mutant 3: F5C/S39C ning to'liq termodinamik tavsifi amalga oshirildi. beri
ZSPA-1 ga nisbatan o'n faktor (Kd=130 ± 20 nM) . Qizig'i shundaki, bu o'sish bilan bog'liq
bog'lash. Pastki ÿC°p, mutant 3:F5C/S39C bog'lanishi kichikroq o'zgarishni aks ettiradi va natijada
termo barqarorlik va bog'lanish yaqinligi. Bu oldingi natijalarga mos keladi (Dincbas-Renqvist va boshq.
ochilgan oqsil fraksiyasini hisoblash. Mutant 3 uchun taxminiy tuzatish: F5C/S39C ostida
ilova
9.4 Barcha sistein mutantlarining natijalari
Machine Translated by Google

---