Hujayra va gen ingenerligi

3. Protoplastlarning qo‘shilishi
Protoplastlarning qo‘shilishi–bu hujayra devori mavjud bo‘lmagan bakteriyalarda sitoplazmatik membranalar sohalarining bevosita tegish qismlarida genetik axborotlarning almashinish mexanizmi hisoblanadi.Hali hujayra devori hosil bo‘lmagan holatdagi ajratib olingan protoplastlar o‘zaro qo‘shilishlari mumkin. Protoplastlarning qo‘shilishi–bu o‘ziga xos gibridizatsiya bo‘lib, juft jinsiy (paraseksual) yoki somatik gibridizatsiya deb nomlanadi. Odatdagi jinsiy hujayralar (gametalar) qo‘shilishidan farq qilib, bunda ota–ona sifatida juft jinsiy gibridizatsiyada o‘simlikning diploid hujayralaridan foydalaniladi. Hujayradan tashqarida joylashgan genetik determinantlar ko‘pgina yuksak tuzilishga ega o‘simliklarda jinsiy usulda, qat’iy tartibda bir hujayrali asosda irsiylanadi. Juft jinsiy gibridizatsiya texnikasi quyidagi holatlar uchun imkon yaratadi:

• 
  Filogenetik jihatdan o‘zaro bir–biridan alohidalangan o‘simlik turlarini (organizmlarni) chatishtirish;
  
• 
  Tarkibida bir nechta xromosomalar, organellalar yoki boshqa hujayra sitoplazmasi bilan birgalikda ota–onalarning birortasining genlar to‘plamini o‘zida saqlovchi asimmetrik gibridlarni olish;
  
• 
  Uchta yoki undan ko‘p sondagi hujayralarni o‘zaro qo‘shish;
  
• 
  Ota–onalar genotiplari umumiy yig‘indisidan tashkil topgan gibridlarni olish;
  
• 
  Geterozigota holatida mutatsiyalarni ko‘chirish, bu jarayon protoplastlarni qo‘shishda hayotchan xususiyatga ega bo‘lgan shakllarni olish imkonini beradi, bunda mutagenez yetarlicha ko‘pincha holatlarda o‘simlik morfogenezi bo‘yicha nuqsonli (defekt) holatlarni yuzaga keltiradi;
  
• 
  Hujayra yadrosidan tashqarida joylashgan genlar bo‘yicha geterozigota holidagi o‘simliklarni olish.
  

Juft jinsiy gibridizatsiya yadroda joylashgan genlarni va shuningdek, yadrodan tashqarida joylashgan genomni tahlil qilish uchun muhim ahamiyatga ega hisoblanadi. Sitoplazmatik genom bir qator belgilarni–jumladan, fotosintez tezligini, patogenlarga, abiotik omillarga (notirik tabiat omillari) va boshqalarga nisbatan barqarorlikni kodlaydi. Genlarning kosegregatsiyasi hodisasi (yadrodan tashqarida joylashgan genom orqali nazorat qiluvchi belgilar birgalikda segragatsiyalanishi) mavjudligi genlarning fizik jihatdan o‘zaro chatishishidan dalolat beradi.
O‘zaro qo‘shilish jarayoni o‘z–o‘zidan amalga oshuvchi, spontan holatda (ko‘pincha yosh to‘qimalar yoki suspenzion kulturalarda) va chaqirilgan ya’ni, indutsirlangan holatda bo‘lishi mumkin. Protoplastlarning qo‘shilishiga turtki berish (stimullash) uchun bir qator usullar tavsiya qilingan bo‘lib, bunda kimyoviy va shuningdek fizik usullar ishlab chiqilgan.
Fizik usullarda protoplastlarning qo‘shilishi G.Simmerman va uning xammualliflari tomonidan 1981–yilda ishlab chiqilgan bo‘lib, bunda protoplastlar bir jinsli bo‘lmagan elektr maydoni asosidagi kameraga joylashtiriladi. Elektrodlarda 2–3 ta protoplastlardan tashkil topgan agregatlar hosil bo‘ladi yoki elektrodlar o‘rtasida 5–6 ta protoplastdan tashkil topgan zanjir hosil bo‘ladi. Qo‘shimcha yakka ko‘rinishdagi doimiy tok impulsi kuchli darajada siqilgan membranalarda tirqishlar hosil bo‘lishga olib keladi, bunda protoplazmaning oqib chiqishi amalga oshadi, shuningdek protoplastlarda tok ma’lum vaqt davomida ushlab turilganda protoplastlar agregatlar ko‘rinishida o‘zaro qo‘shiladi. So‘nib boruvchi tok qo‘shiluvchi protoplastlarning sfera shakliga kirishiga olib keladi.
Qo‘shilish asosini doimiy va o‘zgaruvchan elektr tokining plazmalemmaga turi xil ta’sir qilishi tashkil qiladi. Doimiy elektr maydoni membranani siqilgan holatga olib keladi, o‘z navbatida mahalliy sohalarda buzilishlar yuz beradi, o‘zgaruvchan tok maydoni esa– membranada joylashgan oqsillarning lateral yo‘nalishda diffuziyalanishiga olib keladi va lipidlar joylashgan sohalarda glikoproteidlar mavjud bo‘lmagan bo‘sh sohalar yuzaga keladi, bu sohalarda o‘zaro qarama – qarshi joylashgan membranalar tegish sohalarini yuzaga keltirishi mumkin.



O‘simlik protoplastlarining qo‘shilishi natriy nitrat, kalsiy gidroksid va PEG kabi bir qator moddalar yordamida amalga oshiriladi. PEG ta’sir qildirilishi sharoitida qo‘shilish chastotasi birmuncha yuqori bo‘lishi kuzatiladi, biroq muhitda kalsiy mavjud sharoitda olingan gibridlar asosida bir butun o‘simlikning regeneratsiyalanishi nisbatan oson kechishi qayd qilingan.
Ko‘pincha holatlarda protoplastlarning qo‘shilishi induksiyasida «PEG–ya’ni, muhit rN qiymatining yuqoriligi – Sa²⁺ konsentratsiyasi yuqoriligi» usulidan foydalaniladi, bu holatda 50%gacha protoplastlar o‘zaro qo‘shiladi (rN qiymati 9–10 ga teng, Ca²⁺ konsentratsiyasi 100– 300 mmol/l ni tashkil qiladi). Muhit tarkibida polietilenglikol mavjud sharoitda protoplastlarning kuchli darajada adgeziyalanishi amalga oshadi, polietilenglikol olib tashlanganidan keyin va muhit tarkibiga Ca²⁺ qo‘shilganidan so‘ngra, ularning o‘zaro qo‘shilishi amalga oshadi. Bunda membrananing suyuqlik–mozaikali tuzilish strukturasiga ega bo‘lishi asosida rN va Ca²⁺ ionlari membrananing oquvchanlik xususiyatini oshirishi taxmin qilinadi.
Turli xil o‘simliklarda protoplastlarning o‘zaro qo‘shilishida, masalan A va V o‘simlik protoplastlari qo‘shilishida AA, VV va AV kombinatsiyalarning yuzaga kelishi ehtimolligi teng qiymatga ega hisoblanadi. Istalgan holatda AV qo‘shilish kombinatsiyasi talab qilinadi, shu sababli aynan ushbu tipdagi qo‘shilishlar chastotasini oshiruvchi usullar ishlab chiqiladi va tanlangan tarzda faqat AV qo‘shilish tipi mahsulotigina ajratib olinadi. Bu ko‘rinishdagi usullardan biri quyidagi tamoyilga ega hisoblanadi. Odatda, protoplastlarning yuzasi manfiy zaryadga ega hisoblanadi. Uning musbat zaryadga ega bo‘lgan fosfolipid bilan ishlov berilishi yo‘li bilan vaqtinchalik holatda yuzaga qarama–qarshi zaryad berilishi mumkin. Agar, musbat zaryadga ega bo‘lgan A protoplastlar tashqi yuzasi manfiy zaryadga ega bo‘lgan V protoplastlar bilan o‘zaro aralashtirilsa, u holda o‘zaro qarama–qarshi zaryadlarning bir–biriga tortilishi natijasida asosan AV kombinatsiyadagi qo‘shilishlar yuzaga keladi.
Konyugatsiya vaqtida gametalar funksiyasini bajaruvchi ikkita hujayra protoplastlarining o‘zaro qo‘shilishi amalga oshadi. Bu ko‘rinishdagi hosil bo‘luvchi maxsus kanal orqali qo‘shilish natijasida qalin zigota qobig‘i bilan o‘ralgan holatdagi bir hujayrali holiat hosil bo‘ladi. Garchi fiziologik jihatdan otalik va onalik hujayralari o‘zaro farqlansada, tashqi tomondan ikkita o‘zaro qo‘shiluvchi (konyugatsiyalanuvchi) hujayralar deyarli butunlay farqlanmaydi; biroq bu farqlanishni faqat bilvosita yo‘l bilan va zigota holati bo‘yicha birmuncha vaqt o‘tganidan keyin aniqlash mumkin. O‘zaro qo‘shiluvchi protoplastlarning harakatlanish tezligi (aniqroq aytganda, oqim tezligi) bir xilda bo‘lgan sharoitda, zigota kon’yugatsion kanalda xosil bo‘ladi, ayrim vaziyatlarda konyugatsiyalanuvchi gametangiya– hujayralar devorigacha qalinlashib borishi qayd qilinadi. Bu vaziyatda hujayralarning otalik va onalik hujayralariga ajratilishi chegaraviy darajada shartli hisoblanadi, qo‘shilish jarayonining o‘zi esa–amalga oshish tezligi va morfologik xususiyatlariga ko‘ra teng ahamiyatga ega hisoblanadi va uni izogamiya deb nomlash qabul qilingan. Jinsiy jarayonning bu shakli ko‘pgina konyugat–suv o‘tlari uchun xos xususiyat hisoblanadi. Biroq, evolyusiya nuqtai nazaridan nisbatan rivojlangan zignem suv o‘tlarida izogamiya bilan bir qatorda fiziologik anizogamiya yoki geterogamiya hodisasi ham kuzatiladi. Bu holatda zigota faqat qabul qiluvchi (onalik) hujayrasidan shakllanadi.

Shuningdek, turli xil fluoressent bo‘yoqlar yordamida u yoki bu turdagi o‘simliklarning protoplastlarini markerlash (belgilash) usullari ishlab chiqilgan. Agar, bitta turdagi o‘simlik protoplastlarini fluoresseinizotiotsianat (FITC) bilan ishlov berish amalga oshirilsa, boshqa bir turdagi o‘simlik protoplastlarini esa–rodaminizotiotsianat (RITC) bilan ishlov berilsa, u holda hujayralarning faolligini o‘zgartirmasdan turib, ularni o‘zaro farqlanuvchi ko‘rinishda, ya’ni sarg‘ish–qizil rangda (FITC) yoki qizil rangda (RITC) fluoressent bo‘yalishini ta’minlash mumkin. Turli xildagi tipdagi hujayralarning o‘zaro qo‘shilishi yo‘li bilan hosil qilinuvchi gibridlar har ikkala rangdagi fluoressensiya bo‘yog‘i bilan ishlov berilish xossasiga ega hisoblanadi–ya’ni, sarg‘ish–qizil va qizil rangda bo‘yalishi kuzatiladi.
Hujayra injeneriyasida har ikkala ota–ona hujayralar liniyasidan hosil bo‘luvchi protoplastlarning qo‘shilishi texnikasidan foydalaniladi, bunda somatik (jinsiy bo‘lmagan) gibridlar hosil qilinadi. Ushbu yo‘l bilan odatdagi jinsiy gibridizatsiyadan farqli ravishda bir– biridan yetarlicha darajada alohidalangan mikroorganizmlar, masalan zambrug‘ va bakteriyalar gibridlari hosil qilinishi mumkin. Protoplastlarini olish uchun mitseliylar yoki zambrug‘larning alohida hujayralari hujayra devori hosil bo‘lganidan keyin ichki qismidagi yuqori bosim va tashqi tomonidagi past osmotik bosim ta’sirida yorilib ketmasligi uchun tarkibida osmotik bosim stabilizatorlari–masalan, tuzlar (ammoniy sulfat va boshqalar) yoki 0,3–0,6 M konsentratsiya miqdorida ion tavsifiga ega bo‘lmagan moddalar (sorbit, mannit, saxaroza va boshqalar) mavjud bo‘lgan muhitda suspenziya holatiga keltiriladi. Keyin muhit tarkibiga zambrug‘ hujayra devorini faol tarzda buzish xususiyatiga ega bo‘lgan litik tavsifdagi ferment preparatlari qo‘shiladi. Ushbu fermentlarning ta’sirida bir necha soatdan keyin hujayra devori erib ketadi.
Hosil bo‘lgan zambrug‘ gibridlari protoplastlarning qo‘shilishi yordamida juda samarali ko‘rinishda o‘rganiladi; bu usul sanoat miqyosida yuqori qiymatdagi o‘sish va yuqori qiymatda sefalosporin hosil qilish xususiyatiga ega bo‘lgan Cephalosporium acremonium shtammlarini yaratishda foydalaniladi. Qo‘shish bo‘yicha dastlabki tajribalar jinsiy va para jinsiy tizimlari aniqlanmagan Geotrichum candidum auksotrof mutant zambrug‘larida amalga oshirilgan.
Protoplastlar juft holatda va shuningdek, katta son miqdorida o‘zaro qo‘shilishi mumkin. Qo‘shilish natijasida hosil bo‘luvchi ko‘p yadroga ega bo‘lgan mahsulot o‘z navbatida parchalanadi. O‘simliklar darajasida somatik gibridlarni olish bo‘yicha dastlabki ma’lumotlar 1972–yilda (Karlson va uning hammualliflari tomonidan) paydo bo‘lgan bo‘lib, Rossiyada bu yo‘nalishdagi tadqiqotlar 1975–yilda Butenko R.G. tomonidan laboratoriya sharoitida amalga oshirilgan.
Protoplastlarning o‘zaro qo‘shilishidan keyin genomlarning (yadro va sitoplazmaga oid) taqdiri turli xilda bo‘lishi mumkin, jumladan:

1. 
   Yadroga tegishli genetik determinantlar juft va shuningdek, bitta ota–ona tomonidan irsiylanadi. Bunda ota–ona hujayralardan biri orqali irsiylanish holatida yadro qo‘shilmaydi va natijada hujayraning bo‘linishi jarayoni davomida u segragatsiyalanadi.
   
2. 
   Yadrodan tashqarida joylashgan genetik determinantlar har ikkala ota–ona hujayralar orqali irsiylanadi. Bunda turlar o‘rtasidagi kombinatsiyalarda somatik saralanish va ota–ona hujayralardan birining sitoplazmatik genomining eliminatsiyalanishi tendensiyasi qayd qilinadi.
   
3. 
   Ikkitadan ortiq ota–ona hujayralarning o‘zaro qo‘shilishi natijasida gibrid hujayralar va o‘simliklarning yuzaga kelishi.
   

Shunday qilib, protoplastlarning o‘zaro qo‘shilishi gibrid yuzaga kelishi yoki sibridhosil bo‘lishi orqali amalga oshadi. Somatik gibrid–bu ikkita protoplastning sitoplazmasi va yadrolarining qo‘shilishi mahsuloti hisoblanadi. Sibrid (sitoplazmatik gibrid)–bu tarkibida har ikkala ota–ona hujayralarning sitoplazmasi va ulardan birining yadrosi mavjud bo‘lgan regenerant–o‘simlik hisoblanadi. Sibridlar qo‘shilish oldidan protoplastlarning yadroni parchalash maqsadida γ-nurlanish bilan ishlov berilishi asosida yuzaga keladi. Bu ko‘rinishdagi hujayralarning tekshirilishi (skrining) yadro va sitoplazmaga (mitoxondriya va xloroplastlarga tegishli) genom markerlari asosidagi genlar bo‘yicha amalga oshiriladi. Gibrid hujayralarda mitoxondriya va xloroplastlar DNK sining rekombinatsiyalanishi bo‘yicha ko‘rsatmalar ham mavjud hisoblanadi. Qo‘shilish amalga oshishida asimmetrik gibridlar deb nomlanuvchi qo‘shilish mahsulotlari ham hosil bo‘lishi mumkin, ularda hamkorlardan birining to‘liq holatdagi xromosoma to‘plami va boshqa bir hamkorning xromosomalari to‘plamining qisman mavjud bo‘lishi qayd qilinadi. Bu ko‘rinishdagi gibridlar bir–biridan filogenetik jihatdan alohidalangan organizmlar hujayralari qo‘shilishi davomida yuzaga keladi. Bu holatda ikkita turli xildagi xromosomalar to‘plamining o‘zaro muvofiqlashmagan xossalari asosida hujayralarning noto‘g‘ri bo‘linishi natijasida avlodlar davomida ota–ona hujayralarning birining xromosomalari to‘plami qisman yoki to‘liq holatda yo‘qolishi qayd qilinadi. Asimmetrik gibridlar ota–ona hujayralarning to‘liq ko‘rinishdagi xromosomalar to‘plamiga ega bo‘lgan simmetrik gibridlarga nisbatan barqaror bo‘lishi, hosil berishi va hayotchanlik xususiyatiga ega bo‘lishi mumkin. Asimmetrik gibridizatsiya maqsadlarida ota–ona hujayralarining birining xromosomalarining qisman buzilishi yo‘nalishida ishlov beriladi. Jumladan, bunda hujayraga kerakli xromosoma nishonlangan tarzda kiritilishi ehtimolligi ham mavjud hisoblanadi.
Ikkita jinsiy yo‘l bilan chatishuvchi turlarda protoplastlarning qo‘shilishi ko‘pincha holatlarda barqaror holatdagi amfiploid gibrid hujayralarning hosil bo‘lishga olib keladi, ulardan esa–somatik gibrid hisoblangan–regenerativ o‘simliklar olinishi mumkin. Qayd qilib o‘tish kerakki, protoplastlarning qo‘shilishi usuli nafaqat o‘zaro yaqin bo‘lgan turlar yoki gibrid hujayralar uchungina qo‘llanilishga yaroqli hisoblanmaydi.
Gibridlar uchta va undan ortiq sondagi ota–ona hujayralarning o‘zaro qo‘shilishi yo‘li bilan hosil qilinishi mumkin. Bu ko‘rinishdagi gibridlardan regenerant –o‘simliklar o‘stirilishi mumkin.
Fermentativ gidroliz ta’sirida hujayra devori buziladi va yalang‘och holatdagi hujayralar yoki protoplastlar hosil qilinadi. Bu hujayralar o‘zaro bir–biri bilan qo‘shilish xususiyatiga ega bo‘lib, bu jarayon–o‘simlik hujayralarining juft jinsiy gibridizatsiyasi deb nomlanadi. Qo‘shilishni keltirib chiqaruvchi induktorlar sifatida polietilenglikol muhim o‘rin tutadi, hosil bo‘lgan gibridlar esa–kuchli ishqoriy eritma yoki dimetilsulfoksid bilan ishlov beriladi. Qo‘shilish texnikasi hayvon hujayralarining gibridlari hosil bo‘lishini eslatadi, biroq bunda sezilarli farqlanishlar mavjud hisoblanadi.
Hayvon hujayralarining o‘zaro qo‘shilishi faqat yangi hujayrani hosil qilish imkonini beradi, protoplastlarning o‘zaro qo‘shilishi esa–yangi gibrid o‘simlikni olish uchun asos yaratilishini ta’minlaydi.
O‘simliklar bilan va hatto ajratib olingan o‘simlik hujayralari bilan ishlashning asosiy qiyinchiliklaridan biri–bu hujayra devorining plazmatik membranaga bevosita kirishga to‘sqinlik qilishi bilan bog‘liq hisoblanadi. «Yalang‘och» holatdagi, sferik shakldagi o‘simlik hujayralari– protoplastlar deb nomlanib, in vitro sharoitidagi kultura tarkibida uzoq vaqt davomida moddalar almashinuvi xususiyatini saqlab qoladi, bu holat esa–ular bilan tirik hujayralar ustida ishlash kabi tajribalar olib borish imkonini yaratadi (19–68 rasmlar), bunda bir qator vaziyatlarda juda muhim natijalar olish mumkin. Protoplastlardan xloroplastlar yoki vokuolalar kabi intakt organellalarni ajratib olish hozirgi vaqtda odatdagi ish sifatida qayd qilinadi. Hozirda protoplastlarga katta qiziqish bilan e’tibor berilishi ularning bir–biri bilan qo‘shilish xususiyatiga egaligi (qo‘shilish jarayonida bitta tur yoki turli xil turlarning protoplastlari ishtirok etishi mumkin) bilan bog‘liq hisoblanadi. Bunda barqaror holatdagi, geterokarionlar deb nomlanuvchi gibrid mahsulotlar hosil bo‘ladi. Bu ko‘rinishdagi gibrid protoplastlar huddi odatdagi sharoitdagi kabi in vitro sharoitida o‘simlik devorini regeneratsiyalashi va bo‘linishni boshlashi mumkin. Ko‘pgina vaziyatlarda agar, qo‘shilish nafaqat sitoplazma darajasida, balki turli xil turlarga tegishli bo‘lgan ikkita protoplastning yadrosida ham amalga oshsa, u holda hosil bo‘luvchi geterokariondan bir butun holatdagi, ushbu ikkala turga tegishli xususiyatlarga ega somatik gibrid o‘simlik rivojlanishi mumkin.
Shunday qilib, odatdagi usulda o‘zaro chatishmaydigan turli xil turdagi o‘simliklar protoplastlarining qo‘shilishi usuli yo‘li bilan yakuniy holatda butunlay yangi o‘simlikni yaratish mumkin. Biroq, ko‘pgina vaziyatlarda barqaror holatdagi gibrid shakllarni yaratishga ayrim omillar to‘sqinlik qiladi, jumladan, hali kariotiplarning o‘zaro nomuvofiqligini keltirib chiqaruvchi xromosomalar eliminatsiyasini yuzaga keltiruvchi ayrim omillarning ahamiyati batafsil holatda oydinlashtirilmagan