Hujayra va gen ingenerligi

Parthenocissus tricuspidata va Petunia hybrida protoplastlarini qo‘shishni induksiyalash uchun tarkibi da 5,5%li natriy nitrat mavjud bo‘lgan 10,2%li saxaroza eritmasidan foydalanilgan.
Shunday qilib, Streptomyces coelicolor fertil holatdagi yoki chatishish xususiyatiga ega bo‘lgan tizimni tashkil qiladi (odatda, Streptomyces umuman odatdagi chatishish xususiyatiga ega emas). Agar, polietilenglikol ta’sirida chaqirilgan protoplastlarning qo‘shilishi usulidan foydalanilsa, u holda rekombinatsiyalarning amalga oshishi chastotasi qiymatini taxminan odatdagi chatishishda kuzatiluvchi qiymatga nisbatan to‘rt martagacha oshirish mumkin. Bunda shtammlar selektiv genetik markerlar bilan belgilanishi shart emas, ushbu usuldan foydalanilganda kerakli xossa va xususiyatlarga ega bo‘lgan gibridlarni bevosita tanlab olish amalga oshiriladi. Bu esa sanoat miqyosida talab qilingan xususiyatlarga ega bo‘lgan shtammlarni konstruksiya qilishda katta afzalliklarni yuzaga keltiradi, ayniqsa mos keluvchi markerlarni kiritish ko‘pincha holatlarda qiyin mashg‘ulot hisoblanadi.
O‘simliklar seleksiyasida protoplastlarning alohida darajadagi qimmati ularning bir qator o‘ziga xos xususiyatlari mavjudligi bilan belgilanadi: bunda birinchidan, protoplastlarni katta miqdorda olish mumkin va ulardan foydali xossalarga ega bo‘lgan turli xillarini tanlab olish imkoniyati tug‘iladi. Garchi, protoplastlar genetik jihatdan bir xilda bo‘lsa-da, ulardan hosil bo‘luvchi kalluslar tashqi belgilari bo‘yicha sezilarli darajada o‘zaro farqlanuvchi o‘simliklar rivojlanishini yuzaga keltiradi.
Ikkinchidan, hujayra devorining mavjud emasligi protoplastlarning o‘zaro qo‘shilishi va gibridlar hosil bo‘lishini nisbatan osonlashtiradi. Bunda minimal holatda diploid, somatik hujayralar qo‘shilishi amalga oshib, seleksioner qo‘lida o‘simliklar seleksiyasi uchun tanlash maqsadidagi qudratli qurol yuzaga keladi.
Uchinchidan, hujayra devorining mavjud emasligi begona DNK–fragmentlar– molekulalarning yoki bakteriya plazmidalarining qamrab olinishini osonlashtiradi, natijada esa– butunlay yangi belgilar yig‘indisiga ega bo‘lgan o‘simliklar shakllanadi.
Shunday qilib, o‘simliklar hujayralari asosidagi biotexnologiyaning rivojlanish istiqbollari yetarlicha darajada katta istiqbollarni va’da qiluvchi yo‘nalish hisoblanadi. Bunda yangi dori preparatlari ishlab chiqarilishiga erishiladi, shuningdek oziq–ovqat sanoatida shirin ta’m beruvchi moddalar, o‘simliklarni himoya qilish vositalari, kosmetika va parfyumeriya sanoati uchun keng spektrdagi mahsulotlar olinishi nazarda tutiladi. Bu tezkor ko‘rinishda rivojlanib borayotgan texnologiyalar imkoniyatlari borgan sari ortib boradi va protoplastlarning qo‘shilishi yo‘li bilan hosil qilinish usullarining ishlab chiqilishi asosida yanada kengayadi.
Nicotiana tabacum o‘simligi barg to‘qimalaridan protoplastlarni ajratib olishning standart usuli (Takebe usuli bo‘yicha) quyidagi ko‘rinishda amalga oshiriladi:
Yetilgan, shakllangan barg 60–80 kunlik rivojlanish davridagi yetilgan o‘simlikdan ajratib olinadi va 70% etanolga ivitiladi, keyin esa 15–20 minut davomida 10%li kalsiy gipoxlorat eritmasiga solinadi va ko‘p marta takroriylikda distillangan suvda yuviladi. Pinset yordamida barg ostki qismidagi epidermis qavati olib tashlanadi, epidermis qavati olib tashlangan barg skalpel yordamida 4 sm² o‘lchamdagi uncha katta bo‘lmagan bo‘lakchalarda ajratiladi. Barg epidermis qavatini olib tashlash jarayonini osonlashtirish uchun barglar biroz so‘ligan holatga keltiriladi, shuningdek bunda barglarni kesib olishdan oldin o‘simlikni suv bilan ta’minlashni cheklash ham mumkin.
Keyin to‘qima ketma–ketlik tartibida yoki bir vaqtning o‘zida maseratsiya jarayonini yuzaga keltiruvchi pektinaza va hujayra devori buzilishga olib keluvchi sellyulaza bilan ishlov beriladi. Fermentlarning optimal konsentratsiyasi turli xil to‘qimalar uchun yakka tartibda ishlab chiqiladi. Protoplastlar fermentlar eritmasida minimal vaqt davomida ushlab turiladi va keyin yaxshilab yuviladi. Fermentlar bakterial filtrlar orqali o‘tkazilib sterillanadi.
Hujayrada suv almashinuvining boshqarilishi hujayra devori mavjudligi bilan bog‘liq hisoblanadi. Protoplast «yalang‘och» holatda bo‘lgan sharoitda suv almashinuvini ta’minlovchi komponentlaran biridan mahrum bo‘ladi, shu sababli ajratib olish va kultura sifatida o‘stirish muhitining osmotik xossasini ta’minlash muhim ahamiyatga ega hisoblanadi. Muhit biroz gipertonik xossaga ega bo‘lishi talab qilinadi, bunda protoplastlar yengil tarzda plazmolizga uchratilgan ko‘rinishda bo‘lishi qayd qilinadi. Bu sharoit hujayra devorining qayta tiklanishi (regeneratsiya) va moddalar almashinuvini tormozlaydi. Osmotik stabilizatorlar sifatida qandlar (glyukoza, mannit, sorbit, ksiloza), ion tavsifidagi osmotiklar (CaCl₂, KCl) 0,3–0,8 mol/litr konsentratsiyada foydalaniladi. Konsentratsiya har bir o‘simlik ob’ekti uchun yakka tartibda tanlab olinadi.
Bunda 15^o burchak ostida ushlab turilgan Petri chashkasida to‘qimani fermentlar bilan ishlov berish qulayroq hisoblanadi. Protoplastlarning fermentlar bilan aralashmasi sentrifuga probirkasiga o‘tkaziladi. Fermentativ aralashmadan protoplastlarni ajratib olish ikkita usulda amalga oshirilishi mumkin: sentrifugalash bilan filtrlash yoki flotatsiya usulida bajarilishi mumkin.


Filtrlashda aralashma tirqishlari o‘lchami 40 mkm (mikrometr) ni tashkil qiluvchi filtrlar orqali o‘tkaziladi. Bunda filtrda hujayralarning yig‘ilgan holatdagi yirik qoldiqlari qoladi. Navbatdagi bosqichda sentrifugalash davomida protoplastlar cho‘kadi, hujayra qoldiqlari supernatantda qoladi. Takroriy ravishda sentrifugalashda fermentlarning yuvilishi amalga oshadi, keyin esa protoplastlar kultura holida o‘stirish muhitiga o‘tkaziladi.

Flotatsiya usuli O.Gamborg va uning hammualliflari tomonidan 1981–yilda tavsiya qilingan bo‘lib, kuchsizlantirilgan protoplastlar uchun mo‘ljallangan. Bu usul protoplastlarning hujayra devori yoki hujayra organellalariga nisbatan solishtirilganda past qiymatdagi zichlikka egaligiga asoslaniladi. Boshlang‘ich aralashmaga saxaroza eritmasi qo‘shiladi va 40–80 dan 350 g gacha tezlikda sentrifugalanadi. Toza holatdagi protoplastlar suzib yuradi va hujayra qoldiqlari probirkaning tag qismga cho‘kadi.
Shuningdek, protoplastlarni suspenzion va hujayra kulturalari asosida ham ajratib olish mumkin. Bunda yaxshisi logarifmik o‘sish davrining kechki bosqichidan foydalanish samarali hisoblanadi, bu davrda hujayra devori osonlik bilan buziladi va protoplastlar nisbatan yuqori darajada tirik holatda ajratib olinadi.
Keyin esa–protoplastlar huddi hujayralar o‘stiriluvchi ko‘rinishdagi kultura sharoitida o‘stiriladi. Shuningdek, bunda tuzlar tarkibi ham birmuncha darajada o‘zgartirilishi mumkin. Muhit tarkibi osmotik stabilizator, anorganik birikmalar, uglerod manbai, azot, vitaminlar, fitogormonlardan tashkil topgan bo‘lishi mumkin. Kulturani o‘stirish sharoiti quyidagicha: ya’ni, muhitning rN qiymati 5,4–5,8 ga teng, harorat qiymati +22...+28^oS ni tashkil qiladi, yoritilish darajasi unchalik yuqori emasligi ta’minlanadi (2000 l dan yuqori emas).