Genom va k-DNK genlar kutubxonalari. Genomni DNK darajasida tahlil qilish yoki DNKni zondlar sifatida ishlatish uchun zarur bo’lgan DNK fragmentlarini ajratib olish va aniqlash usullariniishlab chiqilgan. Ushbu fragmentlarning asosiy manbai sun’iy ravishda qurilgan gen kutubxonalari bo’lib, unda kerakli ketma-ketliklarning o’ziga xos xususiyatlariga qarab kerakli DNK sekvenirlashlari qidiriladi yoki skrining qilinadi. Gen kutubxonasi - ma’lum bir manbadan ajratilgan umumiy DNKni kesish yoki mexanik ravishda kesish natijasida olingan, klonlangan, bir-biriga qo’sh zanjir gibridizatsiya qilingan DNK fragmentlarining to’liq to’plamidir. DNKning kelib chiqishiga qarab genom va kDNA gen kutubxonalari ajratiladi. Genom kutubxonalarni qurish uchun to’qimalardan, hujayra kulturalaridan, alohida xromosomalardan yoki ularning bo’laklaridan ajratilgan DNK ishlatiladi. kDNK kutubxonalarini yaratishda total mRNA to’qimalardan yoki o’stirilgan hujayralardan ajratib olinadi, ularda tadqiqotchini qiziqtirgan genlar aniq keltirilgan. Keyingi bosqichda kDNK teskari transkripsiya (RNK-DNK) orqali sintezlanadi. Keyin u kesiladi va klonlash uchun tanlangan vektorga qadoqlanadi kDNK kutubxonalari faqat kodlanadigan - ekzon, gen mintaqalaridan iborat. Kiritilgan DNKning eng qulay hajmi sutemizuvchilar genining o’rtacha kattaligi bilan taqqoslanadi va 15-25 ming tayanch juftligini (kb) tashkil qiladi.
Har bir kutubxonaning axborot hajmi, ya’ni DNKning har xil qismlari joylashtirilgan klonlar soni asl genomning kattaligi va uning har bir ketma-ketligi kamida bitta klonda bo’lish zarurati bilan belgilanadi. Shu sababli, sutemizuvchilarning genom kutubxonalarida odatda kamida 8 10, 5 - 106 turli xil klonlar mavjud.Kutubxonalar ko’pincha fag yoki kosmidalarning klonlash vektorlari asosida quriladi, chunki bu shaklda ximerik DNKni ko’p miqdorda saqlash osonroq. λfag vektorlari, masalan, EMBL3 yoki EMBL4, inson genlari kutubxonalarini yaratish uchun juda qulaydir. Ushbu vektorlarning qadoqlash hajmi 9 dan 23 kb gacha va ular tarkibida ko’plab qulay klonlash joylari mavjud, shuning uchun DNKni kiritish uchun turli xil restriktaza fermentlaridan foydalanish mumkin. Bundan tashqari, ushbu vektorlarda klonlash uchun eng ko’p ishlatiladigan plazmidalar ketma-ketliklari mavjud emas: pBR322 va ColE1. Bu ilgari kiritilgan bo’laklarni kesmasdan fag DNK yordamida kerakli klonlarni tanlashga imkon beradi. Sun’iy achitqi xromosomasi-YAC texnologiyasi DNKning katta mintaqalarini o’z ichiga olgan klon kutubxonalarini yaratish uchun ishlatiladi.
Bunday kutubxonalarda begona DNK fragmentlari kiritilgan kerakli klonlar aniqlangandan so’ng, ikkinchisi fag yoki kosmida kutubxonalarida subklonlashtirilishi mumkin. Kutubxonalarni skrining qilish oligonukleotid, kDNA yoki boshqa har qanday DNK zondlari bilan filtrlarda duragaylash, shuningdek, kutubxona ekspressiyalanadigan vektori asosida tuzilgan bo’lsa, antitanalardan foydalanish orqali amalga oshiriladi, buning uchun kutubxonani tashkil etuvchi ximerik faglar Petri idishlarida ozuqa muhitlarida zich o’stirilgan. Hujayralarni bitta rekombinant fag bilan yuqtirish natijasida alohida lizasga uchragan hujayralar hosil bo’lishi natijasida, bakteriyalar, barcha kulturalar boshqa Petrining idishlariga ko’chiiriladi, toza kulturalar hosil qilinadi. Keyin toza kulturalar uchun filtrlar qo’llaniladi va o’sayotgan va lizisga uchragan koloniyalar ularga o’tkaziladi, oqsillarni va DNKni filtrga biriktirish va belgilangan antitanalar bilan nishonlangan DNK zondi yoki immunoblot bilan blot gibridizatsiyasi (ekspression kutubxonalari uchun) amalga oshiriladi. Filtrlarga bog’lanmagan zondlarni radioavtografiyadan o’tkazilgandan so’ng, kiritilgan DNK fragmentidagi ketma-ketlikni o’z ichiga olgan koloniyalar joyida rentgen plyonkasida zondni yoki o’ziga xos antigenlar bo’lgan joylarda qorong’u dog’lar paydo bo’ladi. Takrorlangan kulturalarda faglarning ijobiy koloniyalarini tanlash namunalard dog’lar hosil bo’lgan joylarda amalga oshiriladi.
DNK sekvenirlashlarini ketma-ketligi.
1869 yilda FridrixMyescher tomonidan kashf qilingan
1944 yildan keyin Osvald Avery, KolinMakLeod va MaklinMakkartitomonidan tozalangan DNK bakteriyalarning bir turini boshqasiga o’zgartirishi mumkinligini namoyish etgan.
1953 yilda JeymsUotson va Frensis Kriklar tomonidan o’rganilayotgan kristallanganrentgen tuzilmalari asosida DNKning ikkispiralli modelini ilgari surdilar.
Oqsillarni sekvensiyalash uchun asos birinchi bo’lib 1955 yilga kelib insulindagi barcha aminokislotalar ketma-ketligini yakunlagan Frederik Sangerning ishi bilan qo’yilgan.
DNK ketma-ketligini aniqlashning birinchi usuli 1970 yilda KornellUniversitetida Ray Vu tomonidan ikkio’lchovlixromatografiyaga asoslangan mashaqqatli usullardan foydalangan holda olingan.
1973 yilda Gilbert va Maksam "DNKning kimyoviy parchalanishi bilan sekvensiyasi" deb nomlanuvchi usuldan foydalangan holda 24 taglik ketma-ketlik haqida xabar berishdi.
Birinchi DNK genomining sekvensiyasi Frederik Sangerning1977 yilda bacterX174 bakteriofagigategishli edi.
1998 yilda Illumina tashkil etilgan va qaytariladigan bo’yoq terminatorlari texnologiyasiga asoslangan ketma-ketlik uslubi va ishlab chiqilgan polimerazalar ishlab chiqilgan.
2001 yilga kelib, odam genomining qoralama ketma-ketligini ishlab chiqarish uchun miltiq ovini tartiblash usullari ishlatilgan.
2010 yilda boshqa metodlar singari OksfordNanopore tomonidan DNK zanjiri ketma-ketligini aniqlash tezligini boshqarish orqali hal qilish mumkinligi ko’rsatishdi.
Tanlangan va klonlangan DNK fragmentini tahlil qilishning keyingi bosqichlari uning fizik xaritasi va nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash, ya’ni ketma-ketliklar hosil qilinadi. Sekvenirlash metodologiyasi juda sodda va uzunligi bir asosga farq qiladigan bir-birini to’ldiruvchi DNK molekulalarini olishdan iborat. Ammo amalda kengaytirilgan DNK molekulalarining nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash juda mashaqqatli vazifadir. Ikkita asosiy sekvenirlash usullari mavjud: kimyoviy - Maksam-Gilbert usulida va sekvenirlash - Sanger usulari. Birinchi holda, bir asosda DNKning kimyoviy parchalanishi, ikkinchisida kerakli DNK zanjiri in vitro sharoitida sintezlanadi, xususan ma’lum asosda sintezni to’xtatadi, ko’pincha sekvenirlashlash uchun Sanger usuli qo’llaniladi, chunki u yanada ishonchli va amalga oshirishi osonroq bo’lgan usullardan biri hisoblanadi.
