Genomika asoslari

41- rasm. DNK sevenirlash uslubi.
Birinchi bosqichda DNK denaturatsiyadan o’tkazilib, bitta zanjirli molekulalar hosil bo’ladi. Keyin ketma-ketlik praymeri qo’shiladi - sun’iy ravishda sintezlangan oligonukleotidlar ketma-ketligi asl DNK molekulasining ma’lum bir mintaqasini to’ldiradi. DNKni duragaylash uchun, ya’ni ikki zanjirli mintaqani hosil qilish uchun sharoitlar yaratiladi va DNK polimeraza va trifosfatlar - dATP, dCTP, dGTP va dTTP qo’shilishi bilan DNK sintezi boshlanadi, ulardan biri radioaktiv hisoblanadi. Sintez to’rtta parallel naychada amalga oshiriladi, ularning har biriga o’ziga xos didezoksinukleotidlar yoki terminatorlardan biri - ddATP, ddCTP, ddGTP yoki ddTTP qo’shiladi. Tegishli nukleotid o’rniga ddNTP qo’shilganda DNK sintezi to’xtaydi. Naychalarning har birida molekulaning oxiridagi ma’lum bir naychaga xos bo’lgan bir xil nukleotid terminatori bilan har xil uzunlikdagi radioaktiv ravishda nishonlangan DNK fragmentlari to’plami olinadi. Ushbu bo’laklarni to’rtta qo’shni yo’lda va radioavtografiyada bir vaqtning o’zida elektroforez ajratishdan so’ng, sintez qilingan fragmentlarning hajmini aniqlash mumkin va shuning uchun didezoksinukleotidlarning lokalizatsiyasi va asl DNK molekulasida tegishli nukleotidlarning tartibi aniqlanishi mumkin. Har bir sekvenirlanish gelida jami 500 ot kuchiga teng bo’lgan birlamchi ketma-ketlikni aniqlash mumkin. Dastlabki versiyasida bu usul ancha zahmatli va qimmatga tushganligini ta’kidlash kifoya. Xalqaro genom dasturida DNK zanjiridagi bitta zvenoning (pog’onaning) narxi bir necha yil oldin 1 dollarga baholangan edi. Sanger usulining modifikatsiyasi sifatida, M13 fag asosida ishlab chiqilgan vektorlarda DNKni oldindan klonlash, denaturatsiya va to’g’ridan-to’g’ri ketma-ketlikda bo’lishi mumkin bo’lgan kengaytirilgan bir zanjirli DNK mintaqalarini olish uchun ishlatiladi. Mp8 va mp9 vektorlari tizimi juda samarali bo’lib, ketma-ketlikni ikkala yo’nalishda bir vaqtning o’zida ketma-ketligini va katta uzunlikdagi bo’laklarni o’qishga imkon berdi. Avtomatik ravishda DNK sekvenirlash metodologiyasi jadal ishlab chiqilmoqda. Turli xil floroxromlar bilan belgilangan didezoksinukleotidlardan foydalanish avtomatik rejimda ommaviy ketma-ketlik uchun ayniqsa istiqbolli bo’lib chiqdi. Ushbu variantda nukleotidlarning har biri geldagi tasma rangiga mos keladi, bu osonlikcha avtomatik ravishda hisobga olinadi. Ushbu usul inson genomi dasturini amalga oshirishda ayniqsa keng qo’llanilishini topdi. So’nggi ma’lumotlarga ko’ra, avtomatik sekvenatorlarning rivojlanishi bitta tahrirning narxini $ 0,5 ga pasaytirdi va ushbu jarayonning samaradorligini keskin oshirdi. Masalan, Amaliy Biosistemalardan 30 ta avtomatik sekvenatorlar 1994 yilda bir hafta davomida 1 million tagacha juftliklarni ketma-ketlikda to’plashlari mumkin edi. So’nggi yillarda printsipial ravishda yangi, yanada samarali va tejamkor sekvenirlash usullari faol ravishda ishlab chiqilmoqda. Oligonukleotid matritsasi deb ataladigan oligonukleotidlar to’plami bilan o’rganilgan DNK ketma-ketligini duragaylash usuli bilan ketma-ketlik usuli ishlab chiqilgan. Buning uchun eng qulay bo’lgan matritsalar to’plamlari - hujayralarida oktanukleotidlar tikilgan (immobilizatsiya qilingan) chiplar ishlatiladi. Ushbu yondashuvning mohiyati ma’lum bir uzunlikdagi 4 ta standart nukleotid (A, G, C, T) mutatsiyasining barcha mumkin bo’lgan variantlari to’plami bashorat qilinib, oktanukleotidlar uchun mumkin bo’lgan nukleotid variantlari soni 65536 ni tashkil qiladi. DNK bo’lagi faqat sekvenirlashlari uning mintaqalarini to’ldiruvchi oktanukleotidlar bilan duragaylashadi. Shunday qilib, tekshirilayotgan DNK fragmentida mavjud bo’lgan barcha mumkin bo’lgan oktanukleotidlar to’plami aniqlanadi. Shundan so’ng, maxsus kompyuterni qayta ishlash yordamida o’rganilgan DNK fragmentida ushbu oktamerlarning joylashuvi buyuriladi. Ushbu istiqbolli usul jarayonni avtomatlashtirish orqali ketma-ketlik vaqtlarini sezilarli darajada tezlashtirishi mumkin.