Genomika asoslari

DNK zondlari, klonlash, vektor tizimlari.
DNK zondalari kattaroq molekulada yoki turli xil DNK molekulalari ichida bir-birini to’ldiruvchi ketma-ketlikni izlash uchun foydalaniladigan, kesilgan har qanday kattalikdagi bir zanjirli DNK bo’lishi mumkin. Ba’zi hollarda, zond sifatida sun’iy ravishda sintez qilingan oligonukleotid DNK sekvenirlashlari ishlatiladi, ularning hajmi odatda 30 nukleotiddan oshmaydi. Genomdan ajratilgan DNK sekvenirlashlari ham zond sifatida xizmat qilishi mumkin. Biroq, ko’pincha bunday ketma-ketliklarni istalgan vaqtda va cheksiz miqdorda olish uchun oldindan klonlanadi. Klonlash tashqi ekzogen DNKni vektorli DNK molekulasiga kiritishni o’z ichiga oladi, bu esa konstruktsiyaning bakterial hujayralariga kirib borishini ta’minlaydi. Ximerik DNK molekulalari kelib chiqishi turlicha bo’lgan bo’laklaridan iborat, rekombinant DNK deb ataladi. O’zgartirilgan plazmidlar, faglar, kosmidlar, retro va adenoviruslar hamda boshqa ba’zi genetik tuzilmalar klonlovchi vektor sifatida ishlatiladi. Klonlangan DNK zondlarining o’lchamlari yuzdan bir necha minggacha nukleotidlarni tashkil qiladi, bu asosan vektorning begona DNK fragmentini saqlab qolish qobiliyatiga qarab belgilanadi. Plazmid DNKsi, ayniqsa, vektor sifatida keng qo’llaniladi.
Plazmidalar bakteriyalar hujayralarida turli xil nusxa ko’chirish hususiyatiga ega bo’lgan, kichik dumaloq, ikki zanjirli DNK molekulalari hisoblanadi. Plazmidalarning kashf etilishi antibiotiklarga chidamliligining genetik mohiyatini o’rganish bilan bog’liq. Hujayralarga turli xil antibiotiklarga qarshilik ko’rsatadigan genlarni tashiy oladigan plazmidalar ekanligi aniqlandi va yuqumli bakteriyalarning ta’siriga sezgirligini yo’qotish aynan shu genetik ma’lumotlarga ega plazmidalarni o’z ichiga olgan shtammlarning tanlanishi bilan bog’liq. Bakteriyalar hujayrasida plazmida mavjudligi uning hayotiy faolligini ta’minlash uchun umuman zarur emas, chunki bakteriyalar muhitida antibiotiklar bo’lmagan taqdirda ham plazmidalarni o’z ichiga olmaydigan shtammlar mavjud.
Plazmidalar avtonom replikatsiyani boshqarish tizimiga ega, hujayralardagi ularning sonini ma’lum darajada ushlab turilishini ta’minlash, har bir hujayra uchun plazmida genomlaridan bir yuzdan bir necha yuzgacha bo’lishi mumkin.Odatda klonlash uchun replikatsiya boshqaruvi zaiflashgan plazmidalar tanlanadi, bu ularning hujayrada ko’p nusxada to’planishiga imkon beradi.
Plazmidani klonlash vektorlarining konstruktsiyasi replikatsiyani boshqarish tizimiga o’zgartirishlar kiritish va antibiotiklarga chidamlilik genlarini yoki klonlash uchun qulay bo’lgan boshqa genetik elementlarni qo’shish yoki kesishdan iborat: maxsus kesish joylari, transkripsiyani boshlash va boshqaruvchi qismlarga ega. Plazmidlar pBR322, ColE1 yoki ularning hosilalari ko’pincha klonlash uchun ishlatiladi. Halqasimon plazmida DNK molekulasi kesish joyida bitta tanaffus bilan osonlikcha chiziqli shaklga aylanishi mumkin. Kirish, joylashtirish, begona DNK fragmentini chiziqli molekulaning uchlariga kiritish maxsus fermentlar-ligazalar yordamida amalga oshiriladi, shundan so’ng gibrid plazmida yana aylana shaklga ega bo’ladi. Bakteriyalarni konvertatsiya qilish uchun juda oddiy va samarali usullar ishlab chiqilgan, ya’ni plazmidalarni bakteriyalar hujayralariga sun’iy ravishda kiritishda, plazmidalarda mavjud bo’lgan antibiotiklarga chidamlilik genlari tegishli selektiv muhitda ularni tanlash uchun transformatsiyalangan bakteriyalarning markerlari sifatida ishlatiladi. Transformatsiya qilingan bakteriyalar ko’payganda, kiritilgan DNK fragmentining nusxalari ko’payadi. Shunday qilib, bakteriyalarga begona bo’lgan genetik materialni deyarli har qanday miqdorda olish mumkin. DNK zondlari sifatida bakteriyalardan ajratilgan plazmid DNKsi yoki plazmidadan ajratilgan qo’shilgan qism ishlatilishi mumkin.Ba’zi maqsadlarda klonlash vektori sifatida faglardan - bakterial viruslardan foydalanish qulayroq bo’lib chiqdi. Fag DNKsi faqat chiziqli shaklda mavjud, shuning uchun kesish vaqtida, ikkita bo’lak hosil bo’lib, ular begona DNK bilan bog’lanib, ximerik fag hosil qiladi. Faqatgina texnik nuqtai nazardan, bu operatsiya plazmidaga kiritilgandan ko’ra osonroq. Shuning uchun, vektorni qurishda, fagning hayotini ta’minlash uchun juda muhim bo’lmagan fag DNK bo’laklari kesiladi. Bunday bakteriyofag, fag DNKsi bilan kattaligi jihatidan o’xshash bo’lgan, begona DNK bo’ladi. Eng muvaffaqiyatli vektorlarga λ fag - lambda gt10, lambda gt11, lambda zap asosida olingan.Molekulyar genetikaning ko’plab muammolari ho’jayin hujayralardagi begona oqsillarni sintezini ta’minlaydigan boshqaruvchi ketma-ketliklarni o’z ichiga olgan ekspressiya qilinadigan vektorlar yordamida muvaffaqiyatli hal qilinmoqda. Shunday qilib, λgt11 misolida, faglarga qo’shilgan DNK ekspressiyasini ta’minlovchi replikativ sharoitda o’stirilishi mumkin. DNK odatda ximerik faglarni tanlashga imkon beradigan marker genining lokalizatsiya hududiga kiritilishi sababli, polipeptid zanjirining bir qismi marker oqsiliga to’g’ri keladigan va zanjirning bir qismi kiritilgan DNK fragm yoki xorijiy DNK tomonidan kodlangan ma’lum mintaqalarga entidagi ma’lumotlarga muvofiq translatsiya jarayonida oqsil sintezi amalga oshiriladi. Ushbu oqsilni marker oqsilining bir qismini antitanalar yordamida aniqlash mumkin.Yaqinda kosmidalarni klonlash, plazmidalar va faglarning afzalliklarini birlashtirgan konstruktsiyalar keng tarqalmoqda. Kosmidalar plazmidlar asosida olinadi, ammo ular fag zarrasida DNKning qadoqlanishi uchun javob beradigan λ fagining genetik elementlarini o’z ichiga oladi. Bunday vektorlar nafaqat plazmidalar shaklida, balki in vitrosharoitida fag zarralari shaklida ham mavjud bo’lishi mumkin. Kosmidalar plazmida va fag vektorlari bilan taqqoslaganda klonlash qobiliyatiga ega va kiritilgan DNKning 40-45 ming tagacha juftligiga ega bo’ladi. Yuqoridagi barcha vektorlar prokariot tizimlarda klonlash uchun ishlatiladi. Eukariot hujayralarga ko’chirish uchun mos bo’lgan vektorlar, prokariot yoki achitqi plazmidalari asosida tuzilgan, bular eukariot hujayralarda mavjud bo’lgan yagona plazmidalar, shuningdek, turli xil ekaryot viruslarni, ko’pincha retroviruslarni, adenoviruslarni yoki adeno bilan bog’liq viruslar ishlatadi. Plazmidalar klonlovchi vektor sifatida ishlatilganda, ularga replikatsiya boshlanishi uchun javobgar bo’lgan viruslar nukleotid qismlari kiritiladi. Eukariot hujayralarga vektorlarni kiritish ko’pincha kotransformatsiya orqali amalga oshiriladi, ya’ni plazmida va begona DNK segmenti bir vaqtning o’zida kiritiladi. Eukariot hujayralarga kiritilgan vektor ketma-ketliklari bir necha kun davomida o’ralgan ekzogen molekulalari sifatida saqlanib turishi mumkin. Kamdan kam hollarda ekzogen DNKni xromosoma DNKga qo’shilishi mumkin. Bunday hollarda kiritilgan ketma-ketliklar ho’jayin hujayralar genomida barqaror saqlanib qoladi va Mendel qonuniga ko’ra irsiylanadi. Hamma genlarni o’z ichiga olgan subxromosomal DNK bo’laklarini klonlash uchun achitqi minixromosomalari tizimi ishlab chiqilgan. Sun’iy achitqi xromosomalari (YAC) achitqi xromosomalarining ma’lum tsentromer va telomer ketma-ketliklarini o’z ichiga olgan plazmida vektorlari asosida quriladi, ular ho’jayin hujayralarida vektorlarni saqlash va takrorlash uchun zarurdir. Bunday tizimlar bir necha yuz minglab yoki hatto millionlab asosiy juftlardan iborat begona DNK fragmentlarini ushlab turishga qodir.
Vektorlarni ho’jayin hujayralariga kiritish usullariga plazmida DNKsining bakteriyalar hujayralariga kiritilishi transformatsiya deb ataladi. Agar genlarni kiritish fag yordamida amalga oshirilsa, bu jarayonga transduktsiya deb ataladi. Eukariot hujayralarga ekzogen DNKni kiritish jarayoni transfektsiya deb ataladi. Ushbu usullarning barchasi plazmida yoki fag DNKlarining hujayra va yadro membranalari orqali o’tishini osonlashtiradigan shartlarni tanlashga asoslangan. Membrana o’tkazuvchanligini oshirish uchun ikki xil yondashuv qo’llaniladi. Birinchi holda, vektorli DNK va ho’jayin hujayralari hujayra va yadro membranalarining o’tkazuvchanligini oshiradigan eritmalar bilan ishlanadi -kaltsiy fosfat yordamida qizdirish usuli, DEAE dekstran vositasi yordamida transfektsiya amalga oshiriladi. Ikkinchi holda, membranalar mikroporalari orqali DNK makromolekulalarining o’tish uchun hujayralarga qisqa muddatli jismoniy ta’sir qo’llaniladi- elektroporatsiya usuli - yuqori voltli elektr maydoniga ta’sir qilish, oltin zarralari bilan "bombardimon" qilish va boshqalar.