Genomika asoslari

Polimeraza zanjiri reaktsiyasi.
DNK zondlari bilan gibridizatsiya va klonlash keyingi yillardagi tadqiqotlarda genom yoki k-DNK ketma-ketliklarini topish va ajratishning yagona usuli edi. Ushbu usullar uchun qilinadigan katta mehnat sarfi bilan bir qatorda tub kamchiliklar va cheklovlarga egadir. Birinchidan, o’rganilayotgan DNK bo’laklari zondlarga nisbatan ancha uzun va to’g’ridan-to’g’ri molekulyar uslublar yordamida tahlil qilish noqulay hisoblanadi. Ushbu ketma-ketliklarning uchlarini tahminan tanlash mumkin emas, chunki ular o’rganilayotgan DNK molekulasida tegishli ravishda kesilgan joylarida mavjud bo’ladi. Ikkinchidan, muvaffaqiyatli kesish va gibridazatsiya uchun katta miqdordagi yaxshi tozalangan yuqori molekulyar og’irlikdagi genom DNKsi talab qilinadi (reaktsiya uchun kamida 10 mikroG). Ushbu DNK miqdori odatda 3-5 ml qondan olinadi. Bundan tashqari, -20⁰ C da DNK ni saqlash sharoitidan tashqari qon ajratib olinganda zudlik bilan ishlatish zarurati tug’iladi va uzoq masofalarga tashish yoki markazlarga yetkazishda namunaning buzilish ehtimoli tug’iladi. Uchinchidan, genom DNK sini duragaylash uchun, qoida tariqasida, kamida 10⁸-10⁹ cpm / mG yuqori spetsifik faollikka ega bo’lgan radioaktiv DNK zondlari talab qilinadi va ulardan juda qisqa vaqt ichida foydalanish talab qilinadi. Bundan tashqari, radioaktiv materiallar bilan ishlash zarur xavfsizlik choralariga rioya qilishni va maxsus izotop bo’linmasining mavjud bo’lishini talab qiladi, bu faqat ayrim diagnostika markazlarida mavjuddir.
Polimerazali zanjirli reaktsiya- molekulyar biologiya uslublaridan biri bo’lib, biologic namunada DNK yoki RNK nuklein kislotalari ma’lum kichik konsentrsiyali fragmentlarining ko’poyishi imkonini beradi. Amplifikatsiya jarayonidan tashqari, PZR, nuklein kislotalar bilan boshqa manipulyatsiyalar o’tkazish imkonini beradi (mutatsiyalarni kirgizish, DNK fragmentlarini o’stirish), biologik va tibbiy amaliyotda patologik holatlarning irsiy va infektsion kasalliklar tashxisida, otalikni aniqlashda, genlarni klonlashda va yangi genlarni ajratib olishda keng qo’llaniladi.
1983 yilda taklif qilingan va 1993 yilda ushbu ixtiro uchun Nobel mukofotiga sazovor bo’lgan amerikalik tadqiqotchi Kori Mullis tomonidan genom DNKsini tahlil qilishning muqobil usuli - polimeraza zanjirli reaktsiyasi (PCR) usuli asrimizning molekulyar biologiyasida epoxa kashfiyoti bo’ldi.
Uslub birinchi marta ishlab chiqilganda, har bir qizdirish-sovutish siklida reaktsion aralashmaga DNK-polimeraza fermentini qo’shish kerak bo’lgan, chunki yuqori haroratda fermant faolligini yo’qotgan. Shuning uchun reaktsiyani o’tkazish samarasi kam bo’lgan, ko’p vaqt va ferment sarfini talab qilgan. 1986 yilda polimeraza zanjirli reaktsiya uslubi modifikatsiyalashadi va uslubni o’tkazishda termofil bakteriyalar DNK-polimeraza fermentini qo’llash taklif qilinadi. Bu fermentlar termostabil bo’lib, reaktsiyalarning bir necha silkini o’tkazishda faolligini yo’qotmaydi. Bu fermentlarni qo’llash, PZR reaktsiyasini avtomatlashtirish va soddalashtirish imkonini berdi. Birinchi termostabil DNK polimerazalar- Thermus aquaticus bakteriyalaridan ajratib olingan va Taq-polimeraza nomi bilan atalgan. Bu polimerazaning kamchiligi, hato nukleotidni kiritish ehtimilligining yuqori bo’lishida va fermentda hatolarni tuzatish mehanizmi mavjud emas, ya’ni 3’→5’ ekzonukleaza faolligiga ega bo’lmaydi. Arxeylardan ajratib olingan Pfu ploimerazalari bunday mehanizmga ega bo’lib, ularni RZR reaktsiyalarida ishlatish, DNK da mutatsiyalar sonini kamaytiradi, lekin ularning ish tezligi Taq plomerazaga nisbatan past hisoblanadi. Hozirgi kunda Taq va Pfu polimerazalar PZR reaktsiyalarida aniq va tez nusxa ko’chirish maqsadlarida keng qo’llaniladi.
Uslub ixtiro etilgan vaqtda Keri Mullis Tsetus corporation kompaniyasida kimyogar-sintetik lavozimida ishlab kelgan va asosan nuqtali mutatasiyalarni aniqlash uchun genom DNKsida gibridizatsiya uslubida, oligonukleotidlarni sintezi bilan shug’ullanagan. Ushbu kompaniya tomonidan birinchi marta PZR reaktsiyasi patent qilinadi. 1992 yilda Tsetus taq-polimeraza asosida PZR reaktsiyasini ishlatish huquqini Hofman-La-Rosh kompaniyasiga beradi.