Genomika asoslari

Southern blot duragaylash usuli. Elektroforez bilan ajratilgan bo’laklar orasida ma’lum DNK molekulalarini aniqlashning eng samarali usullaridan biri 1975 yilda ushbu usulni taklif qilgan muallif Edvard Southern nomi bilan atalgan hozirgi kunda klassik Southern blot duragaylash usuli hisoblanadi. Usulning mohiyati shundan iboratki, genom DNKsi bir yoki bir nechta restriktiv fermentlar tomonidan kesiladi, shundan so’ng hosil bo’lgan bo’laklar agaroza yoki akrilamid gjellarida molekulyar og’irligi orqali ajratiladi. Keyin DNK denaturatsiya qilinadi va gjeldan qattiq tashuvchiga, odatda nitrosellyuloza filtri yoki neylon membranaga ko’chiriladi. O’tkazgichda blotting, kapillyar kuchlar, elektr maydon yoki vakuum ta’sirida amalga oshiriladi. Filtrga ko’chirilgan va yopishgan DNK, radioelementli DNK yoki RNK zond bilan gibridlanadi. Genom DNKsining kerakli qismining elektroforegramdagi o’rni avtoradiografiya usuli bilan aniqlanadi. Blot gibridizatsiyasi DNKning aniq sekvenirlangan qismlarini aniqlash uchun juda sezgir usuldir. Yetarli darajada uzoq vaqt ta’sir qilishda bir necha kun ichida va DNK zondining yuqori o’ziga xos radioaktivligi asosida, 0,1 pikogGacha bo’lgan DNKni aniqlashga imkon beradi.
Usul shuningdek, juda qisqa oligonukleotid zondlari (20 bp) bilan ishlashga imkon beradi, shu bilan birga, usul namunalarni nishonlash va filtrning uzoq vaqt ta’sirlanishini talab qiladi. Sof DNK preparatlari bilan ishlash zarurati, aniq yuqori darajada nishonlangan radioaktiv zondlardan foydalanish, umumiy tadqiqotlaning davomiyligi va unga ketadigan mehnat sarfi usulni juda qimmatga tushiradi. Shunga qaramay, bir qator holatlarda, bugungi kunda ham bu usul o’z ahamiyatini yo’qotmagan, shu jumladan genetik kasalliklar diagnostikasida keng qo’llaniladi. So’nggi paytlarda DNKni nitrat kislota kumush bilan bo’yashning radioaktiv bo’lmagan nishonlash yoki bo’yashning turli xil versiyalari ko’pincha qo’llanilmoqda. Oldindan fragmentlarga bo’lish va elektroforezsiz, qattiq matritsaga tomchilab tomizilgan DNK yoki RNK preparatlarining nishonlangan DNK namunasini gibridlash, mos ravishda dumaloq yoki cho’zinchoq filtrda DNK dog’ining konfiguratsiyasiga qarab nuqta yoki teshikli duragaylash usuli qo’llanilmoqda. Bunday DNK zondlarini elektroforez yordamida ajratilgan RNK molekulalari bilan duragaylash usuli Nothern blot deb ataladi. Western blot yoki immunoblot esa filtrlarga o’rnatilgan elektroforez usulida ajratilgan oqsillarni nishonlangan antitanalarga bog’lash tushuniladi. Ushbu usullarning nomi - DNKni tahlil qilish uchun qo’llaniladigan eksperimental yondashuvlarning rivojlanishiga beqiyos hissa qo’shgan molekulyar genetika fanlari doktori Edvard Soutern hissasi katta bo’lib, ba’zi hollarda DNK zondlari bilan duragaylash DNKni oldindan ajratib olish va tozalashni talab qilmaydi.Gibridizatsiya uslubi nafaqat gel, filtrlarda yoki eritmada, shuningdek gistologik yoki xromosoma namunalarida o’tkaziladi. Ushbu usul duragaylash deb ataladi. Ftorxromlar bilan nishonlangan DNK yoki RNK namunalari zond sifatida ishlatilishi usulining bir variantiga FISH (fluretssein in situ hybridization) deyiladi. Nishonlangan DNK namunasi turli xil rangga bo’yalgan va hibridizatsiya uchun tayyorlangan denaturatsiya qilingan metafaza xromosomalarining namunalariga qo’llaniladi. Gibridizatsiya jarayonini maksimal darajada engillashtiradigan shartlarni tanlash ham muhimdir. Bog’lanmagan DNK molekulalarini yuvgandan so’ng, nurga sezgir emultsiyani, biotin yoki lyuminestsin bilan belgilangan DNK zondlaridan foydalanganda, ishlatilgan DNK zondini to’ldiruvchi DNK sekvenirlashlarini lokalizatsiya joylarini mikroskop ostida, ma’lum xromosomalarning tegishli maydonlari ustidagi xarakterli nuqtalarni to’g’ridan-to’g’ri kuzatish mumkin. In situ sharoitida gibridizatsiya qilish, xromosomalardagi DNK zondini to’ldiruvchi DNK sekvenirlashlarini xaritalashning eng samarali usullaridan biridir. Ushbu uslub, xususan, takrorlanadigan DNK ketma-ketliklarining genom bo’yicha tarqalishini o’rganishda, noma’lum kelib chiqadigan klonlangan DNK ketma-ketliklarida, nafaqat xromosoma bog’liqligini, balki tegishli DNK zondlari mavjud bo’lgan holatlarda xromosomalararo lokalizatsiyasini va noyob genlarini aniqlashda ham samaralidir.
So’nggi ma’lumotlarga ko’ra, odamlarda maxsus tayyorlangan va uzaytirilgan fazalararo xromosomalari bo’yicha o’tkazilgan tajribalarda FISH usulining natijalari 50 kb ga yetishi mumkin, bu o’rtacha xromosoma bandining atigi 1/20 qismidir. Klonlangan DNK parchalarini bir xil xromosoma joylashuvi ichida ham o’zaro joylashtirish muammolari FISH usuli bilan muvaffaqiyatli hal qilinmoqda, gistologik namunalarda olib boriladigan RNK molekulalari va kDNA zondlari o’rtasida in situ sharoitida o’tkazilgan gibridizatsiya iRNK to’qimalarga xos tarqalishini va hujayra ichidagi lokalizatsiyasini tahlil qilishning eng samarali usullaridan biridir. Ushbu va boshqa zamonaviy molekulyar va sitogenetik tahlil usullari, shuningdek ularning ko’p sonli modifikatsiyalari va variantlari haqida tafsilotlarni bir qator ishlar, ko’rsatmalar va sharhlarda topish mumkin.