|
DNK metilasyon tahlil qilish
Nukleotid DNK ketma-ketligini aniqlash usullari metillangan nukleotidlarni aniqlash uchun mos emas. Xususan, polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) yoki bakterial klonlash jarayonida metil belgilari DNKning ikki barobarida saqlanmaydi va epigenetik ma'lumotlar yo'qoladi. DNK hibridizatsiyasi usullari, unda o'rganilayotgan DNK fragmentlarining ketma-ketligini va ularning genomdagi pozitsiyasini aniqlash uchun radioaktiv namunalar qo'llanilmaydi, chunki ular metil va metil bo'lmagan DNKni ajrata olmaydi. Metillangan nukleotidlarni aniqlashning birinchi ishlab chiqilgan usuli endonukleazlarni cheklash (restriktaz) dan foydalanishga asoslangan. Ushbu usulda genomik DNK bir xil ketma — ketlikni taniy oladigan ikkita rezektaz bilan ishlanadi, ammo ulardan biri metilatsiyaga sezgir, ikkinchisi esa yo'q. Usulning g'oyasi shundaki, metillangan sayt faqat metga sezgir bo'lmagan cheklov bilan tan olinishi va kesilishi mumkin Yuqorida tavsiflangan usul inson gemoglobinining lokusida DNK metilatsiyasini tahlil qilish uchun ishlatilgan. Bu lokusning turli genlari tananing rivojlanishining turli bosqichlarida ifodalanadi Tadqiqot shuni ko'rsatdiki, ifoda etilmagan genlar 5m bilan boyitilgan. Cheklovlardan foydalanishga asoslangan usul butun genom darajasida, ya'ni metil darajasida metilatsiyani o'rganishga imkon bermaydi. Hatto lokus ichida metil teglar soni va joylashuvi haqida to'liq tasavvurga ega emas, chunki metilasyon haqida ma'lumot faqat ishlatiladigan restriktazlarni tanib olish saytlarini o'z ichiga olgan saytlardan olinishi mumkin. Shu munosabat bilan, usul soxta salbiy natijalar ko'p beradi. Birinchi marta butun genom darajasida metilasyon, Restriction landmark genomic scanning deb nomlanuvchi usul bilan o'rganildi. Ushbu usul DNK va chu ni buzadigan fermentlarni ham qo'llaydi Shu bilan birga, yuqori aniqlikdagi genomik DNKning metilatsiyasini to'liq tushunish uchun faqat DNK mikrochiplari va yangi avlod tartiblash usullari paydo bo'lishi mumkin edi. RLGS kabi, yangi yondashuvlar ENDONUKLEAZLAR tomonidan DNKning bo'linishini o'z ichiga oladi. O'tish: saytda harakatlanish, qidiruv differential methylation hybridization, DMH) genomik DNKning bir namunasi metilatsiyaga sezgir bo'lgan, ikkinchisi esa metilatsiyaga sezgir bo'lmagan fermentlar bilan qayta ishlanadi. Bundan tashqari, har ikkala namunaning fragmentlari amplifikatsiya qilinadi va turli flüoresan belgilar bilan belgilanadi, undan keyin har ikkala namunadan bir mikrochip uchun parchalar qo'llaniladi. Ushbu lokusda DNK metilasyonu darajasi ikki bo'yoqning nisbiy zichligi o'rtasidagi farq sifatida aniqlanadi. Yuqori darajali ketma-ketlikdan foydalanish DNK mikrochiplarini qo'llashdan ko'ra ko'proq ruxsat olish imkonini beradi. Ushbu usul uchun mikrochip CpG orollarining zichligiga muvofiq qayta tiklanishi kerak metall bo'lmagan sitosin qoldiqlarining kimyoviy konversiyasini o'z ichiga oladi, shuning uchun ular an'anaviy tartiblash orqali aniqlanishi mumkin. Bisulfit natriy va gidroksidi bilan ishlov berilganda, metil bo'lmagan sitosin urasilga aylanadi va metillangan sitozin intaktsiya bo'lib qoladi. Natriy bisulfit bilan davolanmagan DNKning keyingi amplifikatsiya va ketma-ketligi va qayta ishlangan DNK metilasyon saytlarini aniqlash imkonini beradi. Metilasyonga sezgir cheklovlardan foydalanishga asoslangan klassik usullar singari, bisülfit navbati birinchi navbatda alohida lokuslarda metilatsiyani o'rganish uchun ishlatilgan, ammo to'liq genomik tartiblash usullarining paydo bo'lishi uni butun genom darajasida metilatsiyani tahlil qilish uchun ishlatishga imkon berdi. Biroq, restriktazdan foydalanishga asoslangan usullardan farqli o'laroq, bisulfit tartiblash metilatsiya saytini bir nukleotidga aniqlik bilan aniqlash imkonini beradi. Bisulfit usulining cheklovlari quyidagilarni o'z ichiga olmaydi Metilasyonun to'liq genomik tahlil qilish uchun, bisülfit sequencing bilan bog'langan, yangi avlod sequencing texnologiyasidan foydalanadi. Ushbu usullarning kombinatsiyasi metilasyon saytlarini mumkin bo'lgan eng katta metilasyon bilan o'rnatishga imkon beradi, ammo genda o'qish bosqichida bisulfit bilan davolash qilingan DNK ketma-ketligining past murakkabligi bilan bog'liq ko'plab qiyinchiliklar mavjud. Ushbu ta'sirga qarshi kurashish uchun siz o'qishning uzunligini oshirishingiz mumkin; ushbu yondashuv ov miltiq usuli bilan to'liq genomik ketma-ketlikka asoslangan Illumina genome Analyzer platformasidan foydalanadigan wgbs usuli allaqachon Arabidopsis thaliana o'simlik metilomini tahlil qilish uchun ishlatilgan . Bundan tashqari, katta genom organizmlari taqdirda, ayniqsa, tegishli cheklangan vakillik bilan bisülfit tartibida imkoniyatlari bor
Do'stlaringiz bilan baham: |
