Ўзбекистон республикаси олий ва ўрта махсус таълим вазирлиги Қарши давлат университети

2.8-жадвал
Trichoderma harzianum 55 ва 22 замбуруғ штаммларидан олинган алкалоидлар ва терпеноидлар

№	Иккиламчи метаболитлар	Rf	Хроматографик системалар
1.	Индолсирка кислота	0,60	4
2.	Гарзиан кислота	0,62	3
3.	Гиббериллин А3	0,47	8
4.	5-[(2-метокси-фенокси)метил]-1,3-оксазолидин-2-он	0,48	9
5.	2,3-дигидро-1,4-бензпиранол-4	0,69	1

Гиббереллин А₃ ни ажратиш. Trichoderma harzianum harzianum штаммининг 500 мл культурал суюқлигини биомассадан ажратиб РН = 3,5 га тенглиги аниқланди. Эритманинг РН = 3,3 га келгунча 0,5 М ли HCl эритмасидан солинди. Эритмага 5%ли барий хлорид эритмасида чўкма тушмай қолгунча 75мл солинди. Аралашма 30 дақиқа тиндиришга қўйилди ва чўкма Бюхнер воронкасида фильтр қоғоз ёрдамида эритмадан ажратилди. Ажратиб олинган чўкмани қўшимчалардан ажратиш мақсадида 2л водопровод суви билан ювилди. Қолган кристалл модда 70-80⁰С да қуритилди. Қолган қолдиқ 2,1 гр ни ташкил қилди. Бюхнер воронкасидан ўтган эритмани аммиакнинг концентрланган эритмаси билан РН=4,4 га келтирилди. Эритма устига 3 гр FeCl₃ кристалидан солиб чайқатилганда яна оқ чўкма ҳосил бўлди. Ҳосил бўлган чўкмани Бюхнер воронкасида ажратилиб қуритилди. Қуритилган кристалл модда 2,6 гр эканлиги аниқланди. Ажратиб олинган қўнғир рангли техник гиббереллин 2,6 гр ни ташкил қилди [180; - 37-42б, 181; -с. 354-355. ].
Гиббереллинни тоза кристалл ҳолда олиш. Техник гиббереллиндан 2,6 гр олиб, унинг устига эриб кетгунича 50 мл дистилланган сув солинди ва 70-80⁰С гача қиздирилади. Эритманинг РН = 2-2,2 га келгунча 0,5 М ли HCl эритмасидан солинди ва этилацетат билан экстракция қилинади. Экстракция жараёни эритмадаги гиббереллин миқдори 500-700 мг/л гача камайгунча амалга оширилади. Олинган этилацетат экстракти сувсизлантириш учун калций хлорид билан қуритилади ва кейин активланган углерод билан тозаланди. Бунинг учун экстрактга 1% А маркали активланган углерод қўшилади, 20 дақиқа аралаштирилади ва икки қатламли фильтр қоғоз орқали Бухнер воронкасида фильтрланади. Қуритилган ҳамда тозаланган этилацетат концентрати вакуум остида 45 ° C да роторли ҳайдаш ускунасида кристаллар ҳосил бўлгунча буғлатилди. Олинган кристаллар қуруқ этилацетатда қайта кристалланиб тозаланди. Натижада 1,68 гр гиббереллин кристаллари олинди. Олинган кристаллар ЮҚХ асосида ва юқори самарали газ-суюқлик хроматографияси орқали гиббереллин А₃ эканлиги аниқланди.
Культура суюқликларидаги ГК лар миқдори уларнинг фосфор‒молибден вольфрамат комплекси билан ҳосил қилган маҳсулотларнинг фотоколориметрик таҳлили орқали аниқланди [180; - 37-42б, 181; -с. 354-355. 182; -р. 286,183; 28-31 б].
Индол сирка кислотани ажратиш. Культурал суюқликлар таркибидаги ИСК миқдори Gordon ва Weber (1953) таклиф этган усул ёрдамида аниқланди. Озуқа муҳитларига штаммлар экилиб, 35‒45^○С ҳароратда 14 кун мобайнида ўстирилди. Ўстирилган штаммлар фильтрланди ва намуналардан 2 мл дан супернатант олиниб 8 мл Салковски реагенти (50 мл 35% ли HClO₄ ва 1 мл FeCl₃нинг 0,5 М ли эритмалари аралашмаси) билан аралаштирилиб, 20‒30 дақиқага қолдирилди. ИСКли намуналар қизил-пушти ранг ҳосил қилди. Сўнгра ФЭК ‒ КФК‒2 (Россия) фотоколориметрида 530 нм тўлқин узунлигида яшил ёруғлик фильтри орқали супернатантларнинг оптик зичлиги текширилди. Намуналардаги ИСКнинг миқдори ИСКнинг стандарт эгри чизиғи асосида ҳисобланди [162; .-p. 32-43].
Культурал суюқликдан экстракцияси қуйидагича амалга оширилади. Дастлаб штаммлар 250 мл суюқ Чапек озуқа муҳитига экилиб, тебранма инкубаторда 35‒45^○C ҳароратда икки ҳафта давомида ўстирилади. Ўстириш якунлангач, фильтрланиб, супернатант олинади. 1 н HCl ёрдамида олинган супернатантнинг рНи 2,5‒3 туширилиб, этилацетат билан (этилацетат:супернатант 2:1 ҳажмий нисбатда олинади) икки марта экстракция қилинади. Этилацетатли фракция роторли қуриткичда 40^○C да қуритилиб, ИСК олинади [184;.- 28-31 б].
ИСК идентификацияси юпқа қатламли хроматография (ЮҚХ) усули ёрдамида амалга оширилади. Бунинг учун этилацетатли фракция Силикагел пластинкаларига (Силикагел Gf₂₅₄, қалинлиги 0,25 мм) томизилади. Сўнгра этилацетат:хлороформ:чумоли кислота (55:35:10) ёки бензол:бутанол:сирка кислота (70:25:5) билан ишлов берилади. Стандарт ИСК билан бир хил R_f қиймат супернатант таркибида ИСК мавжуд эканлигини кўрсатади [185; 29‒34-б].
Микромицетлар культура суюқликларидан ажратилган ИСК ва бошқа индол ҳалқаси сақловчи бирикмаларнинг газ хроматография‒масс спектроскопияси шароитлари адабиёт манбасида келтирилгандек танланди ва олиб борилди (Kamboj et al., 1999). CP Sil‒5CB‒MS (Chrompack, London, UK) капилляр колонка (25 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 df) интерфейс ҳарорати 275^○С бўлган ион манбасига уланди ва гелий гази босими 40 кПа қилиб белгиланди. Масс‒спектроскопия манбаси ҳарорати 200^○С ва электрон энергияси 70 эВ. Инжектор ҳарорати 250^○С. ИСК ва бошқа экстрактлар юборилгандан сўнг (1 мкл) ГХ ўчоғи 60^○С да 0.7 дақиқа давомида ушлаб турилди ва тақсимлагич ёпилди, сўнг ўчоқ ҳарорати 0,3 дақиқадан сўнг бир дақиқа давомида 27^○С дан 200^○С кўтарилди. Ҳосил бўлган ионларнинг миқдорий ҳисоби Lab‒Base (ThermoQuest, Manchester, UK) дастури ёрдамида аниқланди.