Termiz davlat universiteti botanika kafedrasi

21-gidroksilaza genidagi C1994T mutatsiyasini aniqlashda ishlatiladigan allel-spetsifik praymer va zondlar

Mutatsiya*	Praymer va zond nomlari**	Praymer va zondlar ketma-ketligi*** 5' 3'	Amplikon uzunligi j.n
C1994T	AW8-R	TTCGTGGTCTAGCTCCTCGTG	125
	AM8-R	GTTCGTGGTCTAGCTCCTCGTA
	A8- F	ACTCAGGCTCACTGGGTTGCT
	AP8	6FAMTGATCGGGTGGAGTCCTGCCBH1

*Nukleotidlarni raqamlanishi inittsirlovchi ATG kodonining birinchi nukleotididan boshlanadi.

**Allel spettsifik praymerlar, AW yovvoyi tip alleliga, AM mutant alleliga mos tushadi; F – to’g’ri , R – tekari praymer; AP – TaqMan zondi.

***Matritsani nokomplementar nukleotidi.

12.1-rasm.DNK amplifikatsiya jarayoni

PSR jarayonida renaturatsiya bosqichida DNK zondi DNKning komplimentar zanjiriga birikadi, qancha ko’p amplifikatsiya mahsuloti hosil bo’lsa, shuncha ko’p zond molekulasi o’ziga xos amplikonlar bilan birikadi. Elongatsiya bosqichida polimeraza komplementar DNK zanjirini sintezlaydi va zondga yetganda 5'-ekzonukleaza faolligi yordamida uni parchalaydi. Shunday qilib, fluoretssent belgi va o’chiruvchini ajralishi sodir bo’lib, detektrlanayotgan yorug’likni ko’payishiga olib keladi. Ayonki, ayni vaqtda PSR davomida qanchalik ko’p amplikonlar ishlab chiqarilsa shunchalik yorug’lik intensiv bo’ladi.

Real vaqtdagi PSR-amplifikatsiya uchun kerakli reagentlar to’plami quyidagi funktsiyalarni bajaradi: dd N₂O – erituvchi vazifasini bajarib, uning miqdori o’zgarib turadi. PSR Buffer rN muhitni barqarorlashtirib turadi. dNTF–erkin dezoksinukleotidtrifosfatlar (dNTF - dATF, dSTF, dGTF, dTTF) bo’lib, ular yangi DNK zanjiri uchun zarur. MgCl₂ – DNK zanjirini turg’unligini ta’minlab turadi. Praymer – com (F, R) – DNKning ikkinchi zanjirini sintezlaydi. Praymer – ( angl. primer) – nishon DNK yoki RNKga komplimentar bo’lgan qisqa nuklein fragmenti (oligonukleotid) bo’lib, DNK-polimeraza yordamida komplimentar zanjirini sintezlash uchun “tomizg’i” sifatida xizmat qiladi. ”Tomizg’i” DNK-polimerazalar uchun yangi zanjirni praymerning 3'-uchidan (ONdan) sintezini initsiatsiyasi uchun kerak. DNK-polimeraza praymerni 3'-uchiga matritsa zanjiriga komplementar bo’lgan nukleotidlarni qo’shadi. Bu praymerlar umumiy. Primer – Wt (Mut) – bitta probirkaga yoki Wild ture, yoki Mutant solinadi. Zond – Real vaqtdagi natijani olish uchun ahamiyatli va u flouressensiyani beradi . Har bir CUR21 geni mutatsiyalari uchun alohida zondlar ishlatiladi. Tak-polimeraza–DNK zanjiri sintezini ta’minlaydi.

NAZORAT SAVOLLARI

1. 
   Polimeraza zanjir reaksiyani borishida asosiy ahamiyatga ega fermentlar?
   
2. 
   Hozirgi kunda DNK bo’lagini avtomatik ko’paytirishda qanday usullardan foydalanilmoqda?
   
3. 
   Replikatsiya jarayonini izohlang?
   

№