Termiz davlat universiteti botanika kafedrasi

CYP21genini amplifikatsiya qilish uchun ishlatilgan praymerlar:

Forward (U1-F) 5’-GAGTACCTTGGAGGGCCTGCT-3’;

Reverse (F3-R) 3’-GCTACACTCCAGCGTCTGAGG-5’.

PSR-amplifikasiyani o’tkazishda quyidagi dastur yordamida olib borildi. PSR-amplifikasiyasini o’tkazish dasturi

Bosqich	Harorat,°C		Vaqt,min	Sikl
Denaturasiya	95.0		4:00	1
	94.0		0:20	45
Renaturasiya	64.0		0:40
Elongasiya	72.0		3:00
Yakunlovchi elongasiya	72.0	5:00		1

Amplifikattsiya tugagandan so’ng, hamma probirkalarni elektroforez xonasiga ko’chirildi va 5-10 mkl PSR mahsuloti 1,2 % elektroforez usuli bilan aniqlandi.

Real vaqtdagi (Real-time PSR) PSR-amplifikatsiyasini o’tkazish TBGP bilan assotsiattsiyalangan CYP21 genida tez-tez uchrovchi mutatsiyalarni aniqlash uchun yangi DNK-diagnotsika sistemasi ishlab chiqarilgan bo’lib, uning asosida Real vaqtdagi PSR-amplifikattsiya (Real-time Polymerase Chain Reaction) yotadi, tez-tez uchrovchi 8 ta mutattsiyalar uchun yangi allel-spettsifik praymer (qisqa oligonukleotid fragmentlari) va TaqMan zondi ishlatiladi. Avvaliga metod sun’iy matrittsada test qilib ko’rilgan, bunda yo’nalishli mutagenez yordamida analiz qilinuvchi mutattsiyaga kiritiladi va keyin giperandrogeniyaning klinik va bioximik belgilari namoyon bo’lgan 20 ta bemorning klinik materiali bo’lgan DNK da tekshirilgan va ulardan bittasida mutattsiya topildi: u nonsens (nukleotidlar ketma-ketligi almashishi natijasida aminokislotalar o’zgarishidan yoki stop kodon paydo bo’lishi natijasida yuzaga keladigan mutatsiya) – mutatsiya +318X bo’lib, aminokislotalarning o’rin almashishidan kelib chiqadigan mutattsiya hisoblanadi. Shunday qilib, CYP21 genining PSR mahsulotlari real vaqtdagi PSR-amplifikattsiyada o’tkazilib, natijada aniq natijalar olinadi.

Bu metod 5'-ekzonukleaza polimeraza faolligiga asoslangan. Reaktsion aralashmada muhim komponent hisoblangan DNK zondlar o’zida 5' holatdagi fluoretssent bo’yoq va 3' holatdagi fluoretssentsiyani o’chiruvchi (masalan, FAM _TGATCGGGTGGAGTCCTGCC_BH1zondini oladigan bo’lsak, bu yerda FAM - fluoretssent bo’yoq bo’lsa, BH1 esa fluoretssentsiyani o’chiruvchidir, ular orasida ma’lum bir nukleotidlar ketma-ketligi joylashgan) kabi qismlardan iborat hamda fosfat guruh 3' holatda joylashgan bo’ladi. Bu zondlar amplifikattsiyalanayotgan sohada komplimentarlik asosida joylashadi. Fluoretssent o’chiruvchi fluoretssent bo’yoq tomonidan ajralayotgan yorug’likni yutadi, fosfat guruhi esa 3' holatdagi polimerazani bloklaydi. Agar WT aralashmasi bo’lgan namunada FAM flyuoretssent bo’yog’ini oshishi kuzatilsa C1994T mutattsiyasi namoyon bo’lmaydi.

Geterozigota mutattsiyani mavjudligida esa bir vaqtning o’zida Wild Type va Mutant aralashmalaridagi namunalarda flouressentsiya bo’yoq – FAMni ko’payishi kuzatiladi. Faqat Mutant aralashmasidagi namunalarda flyuretssentsiya bo’yoq – FAMni ko’payishi esa gomozigota mutatsiyadan darak beradi.