С. А. Эгамбердиева молекуляр

 
НАЗОРАТ САВОЛЛАРИ 
1.
Рекомбинант ДНК қандай олинади? 
2. Генларни вертикал ва горизонтал кўчиришни тавсифланг. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

---

73 
§ 12. ДНКни кимёвий синтези, нуклеотид кетма-кетлигини 
аниқлаш
 
1.
ДНК кимёвий синтезининг аҳамияти 
2.
ДНКни секвенирлаш усуллари 
3.
ДНКни секвенирлашнинг дидезоксинуклеотид усули 
4.
Клонлаш ва секвенирлаш учун бактериофаг М13 дан 
фойдаланиш 
 
Молекуляр биотехнология учун энг муҳим бўлган усуллар 
қаторига генларни клонлашдан ташқари ДНК кимёвий синтези, 
ДНКни секвенирлаш ва полимераза занжир реакцияси (ПЗР) киради. 
ДНКнинг ўзи ҳамда унинг репликацияси механизмининг энг 
муҳим тадқиқотлари давомида олинган маълумотлар туфайли 
эндиликда ДНКнинг бир молекуласини синтезлаш, бошқасининг 
нуклеотид кетма-кетлигини аниқлаш ва учинчисини ПЗР ёрдамида 
амплификациялаш имкони пайдо бўлди. 
Бир занжирли ДНК-фрагментларини берилган нуклеотид 
кетма-кетлиги билан кимёвий синтезлашнинг тез ва унчалик қиммат 
бўлмаган усуллари ишлаб чиқилиши билан молекуляр клонлаш ва 
ДНКни тавсифлаш методологияси жиддий равишда ўзгарди.
Кимёвий синтезнинг мақсади in vitro шароитида бир занжирли 
ДНК молекуласини олишдан иборат. Бу ерда фақат фосфодиэфир 
боғламлари ҳосил бўлишининг самарадорлиги юқори бўлгандагина 
муваффақиятга эришиш мумкин. Акс ҳолда жараён тугагач жуда кам 
сонли керакли ўлчамдаги молекулалар олинади. In vitro шароитида 
синтезланган молекулаларнинг узунлиги одатда 20-30 нуклеотидни 
ташкил қилади ва кам ҳолларда 100 нуклеотиддан ошади.
Икки занжирли молекулаларни олиш учун комплементар 
занжирлар бир-биридан алоҳида синтезланади ва кейин бир турнинг 
битталик полинуклеотид занжирларидан икки занжирли ДНК 
молекуласини аста-секин совутиш йўли билан отжиг қилиш – тиклаш 
(ренатурация) жараёни ўтказилади
.
Бундай йўл билан олинган 
ДНКдан бутун ген ёки унинг фрагментларини конструкциялаш, ДНК 
амплификацияси, ажратиб олинган ДНКнинг йўналтирилган 
мутацияси, шунингдек, гибридизацияда зонд сифатида ва клонлашни 
енгиллаштирадиган линкер сифатида фойдаланиш мумкин. 

---

74 
ДНКнинг автоматик кимёвий синтези учун воситалар (ДНК-
синтезаторлар) пайдо бўлиши билан ≤50 занжир звеноси узунлигига 
эга бир занжирли олигонуклеотидларни олиш бирмунча оддий 
жараён бўлиб қолди. Ҳар қандай ДНК-синтезаторнинг асосий 
компоненти клапанлар ва насосдан иборат. Улар ёрдамида реакцион 
аралашмага қатъий белгиланган дастур бўйича керакли мономер 
бирликларни 
ўсиб 
бораётган 
занжирга 
бирлаштиришни 
таъминлайдиган нуклеотидлар ва реагентлар киритилади. ДНК 
биологик синтезидан фарқли ўлароқ кимёвий синтез давомида ҳар 
бир янги нуклеотидни занжирнинг 5ʹ-гидроксил учига бириктириш 
мумкин. Барча реакциялар кетма-кетликда бир реакцион колонкада 
амалга оширилади, улардан ҳар бирининг давомийлиги ва ювиш 
вақти эса компьютер ёрдамида назорат қилинади. 
Ҳозирги вақтда фосфорамидит усули ДНК кимёвий 
синтезининг энг кенг тарқалган усулларидан бири ҳисобланади. Унда 
дастлабки 
қурилиш 
блоклари 
модификацияланган 
дезоксирибонуклеозидлар 
ҳисобланади. 
Модификация 
дезоксиаденозин ва дезоксицитидин аминогуруҳларига бензол 
гуруҳи, дезоксигуанозин аминогуруҳига эса изобутирил гуруҳи 
бирлашишидан 
иборат. 
Аминогуруҳи 
бўлмаган 
тимидин 
модификацияланмайди. Бундай модификация нуклеозидларни 
занжир ўсиб боришидаги ноҳуш ножўя реакциялардан ҳимоялаш 
учун зарур. Синтез қаттиқ фазада амалга оширилади (ДНКнинг ўсиб 
бораётган занжири қаттиқ ташувчида фиксацияланади), бу эса барча 
реакцияларни бир идишда ўтказиш, ҳар бир босқичдан кейин 
кераксиз реагентларни ювиб ташлаш ва янгиларини реакцияларни 
имкон қадар тўлиқ ўтказишни таъминлайдиган миқдорда қўшиш 
имконини беради. 
Кўп поғонали синтез босқичлари 12.1.-расмда акс эттирилган.

---

75