С. А. Эгамбердиева молекуляр

Расм 10.1. кДНК синтези. Тозаланган мРНК препаратига праймер 
oligo(dT) қўшилади. РНК-матрицада ДНК синтези учун тескари 
транскриптаза ферменти ва тўртта dNTPдан фойдаланилади. In vitro 
шароитида тескари транскриптаза барча матрицаларда тўлиқ ўлчамли 
кДНК-нусҳалар синтезини таъминламайди ва ўсиб бораётган занжир 
учида эркин 3'-ОН-гуруҳ билан шпилка ҳосил қилади. Бу гуруҳ Кленов 
фрагменти 
иштирокида 
ДНК 
иккинчи 
занжири 
синтезини 
инициациялайди. Молекула синтези якунлангандан кейин мРНК 
РНКаза II билан гидролизланади, ДНКга эса нуклеаза SI билан ишлов 
берилади, натижада ДНКнинг тўмтоқ учли шпилкасиз чизиқли 
молекулалари ҳосил бўлади 
(Глик ва Пастернак бўйича
). 
 
Реакцион аралашмага 
E.coli 
ДНК-полимераза I нинг биринчи 
занжирдан матрица сифатида фойдаланиб, ДНК иккинчи занжирини 

---

68 
охиригача қуриб битказадиган Кленов фрагменти қўшилади. У 
дизоксирибонуклеозидларни шпилканинг 3ʹ-OH-учидан бошлаб ўсиб 
бораётган занжирга бирлаштиради. Синтез тугатилгандан кейин 
препаратга мРНК молекулаларини ажратадиган РНКаза H ферменти 
ва ДНК бир занжирли учларини ажратадиган нуклеаза S1 ферменти 
билан ишлов берилади. Олинган препарат мРНКнинг икки занжирли 
комплементар ДНК-нусҳалари (нДНК) дастлабки намунада устунлик 
қиладиган қисман ёки тўлиқ аралашмасидир. 
Турли хил кДНКни плазмид векторга киритиш ва нДНК-
кутубхонани ҳосил қилиш мумкин. Специфик гибрид плазмидаларни 
ташувчи 
клонларни 
идентификациялаш 
мақсадида 
нДНК-
кутубхонани скрининглаш учун гибридизация ёки иммунологик 
усуллардан фойдаланиш мумкин. Охирги ҳолатда кДНК 
транскрипцияни таъминловчи бактериал промотор назорати остида 
турадиган сайтга жойлаштирилиши керак. Бироқ, ҳеч қайси вектор 
жойлаштирилган нДНКда тўғри ўқиш рамкаси сақланишини ва тўғри 
полипептид занжир синтезланишини кафолатламайди. Шундай 
бўлса-да, у ёки бу усул ёрдамида аниқланган барча ижобий клонларни 
яна текшириш ва улардан оқсил-нишонни кодлайдиган тўлиқ 
ўлчамли нуклеотид кетма-кетлигини (таниб олиш жойи) ажратиш 
зарур. 
Генларни клонлаш бўйича типик тажриба қуйидаги 
босқичларни ўз ичига олади. 1. Организмдан ажратиб олинган зарур 
бўлган генни ўз ичига олган ДНКнинг рестриктазали бўлиниши. 2. 
Клонлаш (одатий плазмидали) учун донор ДНК бўлинишида 
фойдаланилган рестриктазалар ёрдамида ҳужайра-хўжайинда 
репликацияланиши мумкин бўлган векторга ишлов бериш. 3. 
ДНКнинг шу икки намунасини аралаштириш ва фаг Т4 ДНК-лигазаси 
ёрдамида фрагментиларни бириктириш. 4. Хўжайин-ҳужайраларнинг 
бириктирилган 
молекулалари 
билан 
трансформациялаш. 
Трансформацияланган 
ҳужайраларда 
рекомбинант 
ДНКни 
амплификациялаш.