Производство иммунобиологических лекарственных препаратов Производство противобактериальных вакцин и бактериальных антигенов-диагностикумов

Клон, продуцирующий антитела одной специфичности - моноклональные антитела можно получить помимо гибридомной технологии (путем гибридизации В-лимфоцитов с миеломными клетками) технологией рекомбинантной ДНК (рекомбинацией генов, кодирующих синтез константных и вариабельных доменов антител).

• Клон, продуцирующий антитела одной специфичности - моноклональные антитела можно получить помимо гибридомной технологии (путем гибридизации В-лимфоцитов с миеломными клетками) технологией рекомбинантной ДНК (рекомбинацией генов, кодирующих синтез константных и вариабельных доменов антител).
• Используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК (к примеру, кодирующие CDR участки мышиных антител, полученных гибридомной технологией). Проводят раздельную ПЦР-амплификацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи. Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей. кДНК, кодирующие, соответственно Н- и L-цепи Fv-фрагмента, встраивают в вектор, в геном бактериофага. Затем среди рекомбинантных бактериофагов, in vitro отбираются те, которые в большем количестве экспрессируют белок CDR, способный связываться со специфическим антигеном.
• Метод рекомбинантной ДНК в отличие от гибридомной технологии позволяет существенно повышать аффинность синтезируемых антител (оптимизировать сайты связывания с антигеном).

Схема репликации ДНК

С целью продукции рекомбинантных антител, модифицированную кДНК встраивают в векторы экспрессии и трансформируют ими подходящие клетки-хозяева (микроорганизмы, чаще E.coli, или клетки млекопитающих).

• С целью продукции рекомбинантных антител, модифицированную кДНК встраивают в векторы экспрессии и трансформируют ими подходящие клетки-хозяева (микроорганизмы, чаще E.coli, или клетки млекопитающих).
• Для синтеза полноразмерных рекомбинантных антител векторы экспрессируют в клетках млекопитающих. Только в эукариотических клетках возможна правильная сборка белковой молекулы и гликозилирование, необходимое для выполнения антителами эффекторных функций. Подобные системы регуляции в прокариотных клетках отсутствуют. Полученный в результате отбора клон лимфоцитов, продуцирующий рекомбинантные антитела культивируется в биоректоре.
• В современных технологиях используются биореакторы с полыми волокнами, стенки которых образованы полупроницаемыми мембранами. По волокнам циркулирует культуральная среда, компоненты которой проникают через полупроницаемые мембраны в основной отсек, где находятся культивируемые клетки, в нем собираются синтезируемые антитела, они не проникают через полупроницаемую мембрану.
• Важным преимуществом данного метода культивирования является сравнительно высокая концентрация конечного продукта – антител.
• Собранная культуральная среда, содержащая продуцированные клетками антитела, подвергается очистке аффинной, ионообменной и гель-проникающей хроматографией, чтобы получить высокоочищенные белки — антитела.