Аминокислот в белках, пептидах и лекарственных препаратах

Разделение ФТК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой 
ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным достигается 
путем подбора концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. 
Элюируемые из колонки ФТК-производные аминокислот определяют при длине 
волны 254 нм.
Предел обнаружения для большинства ФТК-производных аминокислот 
обычно составляет 1 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 20—500 
пмоль 
с 
коэффициентом 
корреляции 
более 
0,999. 
Для 
получения 

---

удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать 
образцы белка/пептида массой более 500 нг. 
МЕТОД 4. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 6-АМИНОХИНОЛИЛ-
N-
ГИДРОКСИСУКЦИНИ-МИДИЛКАРБАМАТОМ 
Предколоночная дериватизация аминокислот с 6-аминохинолил-N-
гидроксисукцинимидилкарбаматом (АХК) проводится перед разделением смеси 
аминокислот 
методом 
обращенно-фазовой 
ВЭЖХ. 
АХК 
реагирует 
с 
аминокислотами с образованием стабильных флуоресцирующих несимметричных 
производных мочевины (АХК-аминокислот), которые легко поддаются анализу 
методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.
Разделение АХК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой 
ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, достигается 
подбором концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. 
Селективное флуоресцентное детектирование производных при длине волны 
возбуждающего света 250 нм и при длине волны излучаемого света 395 нм 
допускает прямой ввод реакционной смеси без каких-либо существенных 
поправок на основной флуоресцирующий побочный продукт — 6-аминохинолин. 
Избыток реактива быстро гидролизуется (t
1/2
< 15 
с) с образованием 6-
аминохинолина, N-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, а через 1 мин 
дальнейшее образование производных не происходит.
Площади пиков для АКХ-аминокислот, по существу, не изменяются, по 
меньшей мере, в течение 1 недели хранения растворов при комнатной 
температуре. Следовательно, АХК-аминокислоты обладают более чем 
достаточной стабильностью для проведения круглосуточного автоматического 
хроматографического анализа. Предел обнаружения для каждой аминокислоты, 
кроме цистеина, находится в области от 40 фмоль до 320 фмоль.
Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль. 
Линейность сигнала наблюдается в области 2,5—500 мкмоль с коэффициентом 
корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных данных 
рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой 
более 30 нг. 
МЕТОД 5. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ 
АЛЬДЕГИДОМ 
Предколоночная дериватизация аминокислот с о-фталевым альдегидом 
(ОФА) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-
фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Метод не позволяет 
определять аминокислоты, являющиеся вторичными аминами (например, 
пролин).
ОФА в присутствии тиольных соединений реагирует с первичной 
аминогруппой, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. В 
качестве тиольных соединений могут быть использованы 2-меркаптоэтанол и 3-
меркаптопропионовая кислота. ОФА не обладает флуоресценцией и, 
следовательно, не образует мешающих пиков. Кроме того, его растворимость и 
стабильность в водном растворе, наряду с высокой скоростью реакции, позволяет 
проводить автоматическую дериватизацию с использованием автодозатора для 
смешивания испытуемого образца и реагента. Основным недостатком ОФА 
является отсутствие у него способности реагировать со вторичными 
аминокислотами (например, пролином). Компенсировать данный недостаток 
можно сочетанием с методиками, описанными в методах 7 или 8.

---

Предколоночная дериватизация аминокислот с ОФА используется для 
пробоподготовки перед обращенно-фазовой ВЭЖХ. Так как ОФА-производные 
аминокислот неустойчивы, анализ и разделение методом ВЭЖХ проводят 
немедленно после дериватизации. Хроматограф для жидкостной хроматографии 
должен быть оснащен флуометрическим детектором для обнаружения 
производных аминокислот. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных 
аминокислот измеряют при длине волны возбуждающего света 348 нм и длине 
волны излучаемого света 450 нм.
Заявленный предел обнаружения при флуориметрическом детектировании 
не ниже 50 фмоль, однако на практике предел обнаружения составляет 1 пмоль. 
МЕТОД 6. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С (ДИМЕТИЛАМИНО)-
АЗОБЕНЗОЛСУЛЬФОНИЛХЛОРИДОМ 
Предколоночная 
дериватизация 
аминокислот 
с 
(диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом 
(ДАБС) 
проводится 
перед