Аминокислот в белках, пептидах и лекарственных препаратах

---

01/2016:20256 
2.2.56. АМИНОКИСЛОТНЫЙ АНАЛИЗ 
Аминокислотный анализ относится к методологии, используемой для 
определения аминокислотного состава или количественного содержания 
аминокислот в белках, пептидах и лекарственных препаратах. Белки и пептиды 
представляют собой макромолекулы, состоящие из ковалентно связанных 
остатков 
аминокислот, 
которые 
образуют 
линейные 
полимеры. 
Последовательность аминокислот в белках или пептидах определяет свойства 
молекулы. Белки представляют собой крупные молекулы, которые обычно 
существуют в виде сложных структур со специфической конформацией, в то 
время как пептиды имеют меньший размер и могут состоять только из нескольких 
аминокислот. 
Аминокислотный 
анализ 
может 
быть 
использован 
для 
количественного определения белков и пептидов, идентификации белков или 
пептидов на основе их аминокислотного состава, структурного анализа белков и 
пептидов, оценки стратегий фрагментации для картирования пептидных остатков 
и обнаружения атипичных аминокислот, которые могут присутствовать в белках 
или пептидах. Перед аминокислотным анализом необходимо гидролизовать 
белки/пептиды до получения отдельных аминокислотных составляющих. После 
гидролиза белков/пептидов процесс аминокислотного анализа может быть таким 
же, как и для свободных аминокислот в других лекарственных средствах. 
Аминокислотные составляющие испытуемого образца перед анализом обычно 
подвергаются химической модификации (или дериватизации). 
ОБОРУДОВАНИЕ 
Методы, используемые для аминокислотного анализа, обычно основаны на 
хроматографическом разделении аминокислот, присутствующих в испытуемом 
образце. Современные методики анализа основаны на использовании 
автоматизированных хроматографических приборов для решения аналитических 
задач. В качестве прибора для аминокислотного анализа обычно используют 
жидкостный хроматограф низкого или высокого давления, способный создавать 
градиентное элюирование подвижной фазой, что обеспечивает разделение 
анализируемых аминокислот на хроматографической колонке. Если анализ 
образца не осуществляется с использованием предколоночной дериватизации, 
прибор должен иметь устройство для постколоночной дериватизации. В качестве 
детектора 
обычно 
используется 
спектрофотометрический 
детектор 
в 
ультрафиолетовой/видимой 
области 
или 
флуоресцентный 
детектор 
в 
зависимости от используемого метода дериватизации. Регистрирующее 
устройство (например, интегратор) используется для преобразования аналогового 
сигнала из детектора и для проведения количественных вычислений. 
Предпочтительно, 
чтобы 
прибор 
использовался 
исключительно 
для 
аминокислотного анализа. 
ОБЩИЕ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 
При выполнении аминокислотного анализа аналитик всегда должен 
учитывать возможность фонового загрязнения. Необходима высокая степень 
чистоты реактивов (например, низкая чистота хлороводородной кислоты может 
способствовать загрязнению глицина). Аналитические реактивы должны меняться 
регулярно каждые несколько недель, при этом должны использоваться только 

---

растворители класса «для высокоэффективной жидкостной хроматографии 
(ВЭЖХ)». Возможное загрязнение микроорганизмами и посторонними частицами, 
которые могут присутствовать в растворителях, устраняется путем фильтрования 
этих растворителей перед применением, хранением растворителей в закрытых 
емкостях и размещением прибора для аминокислотного анализа в защищенном от 
прямого солнечного света месте.
Качество аминокислотного анализа определяется лабораторной практикой. 
Приборы размещают в местах наименьшего передвижения персонала. 
Лабораторию содержат в чистоте. Очищают и калибруют пипетки согласно 
графику. Наконечники пипеток хранят в закрытой коробке; аналитикам не 
позволяется трогать их незащищенными руками. Аналитик должен использовать 
неопудренные латексные или аналогичные перчатки. Ограничивают число 
открываний и закрываний флакона с испытуемым образцом, так как пыль может 
приводить к завышению результатов по содержанию глицина, серина и аланина.
Для получения удовлетворительных результатов аминокислотного анализа 
прибор необходимо обслуживать надлежащим образом. Если прибор 
используется по стандартной программе, он должен ежедневно проверяться на 
отсутствие протечки, стабильную работу детектора и ламп и способность колонки 
поддерживать необходимую степень разделения индивидуальных аминокислот. 
Согласно графику проводят очистку или замену всех фильтров прибора и другое 
техническое обслуживание. 
СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ 
Необходимые стандартные образцы аминокислот для проведения 
аминокислотного анализа коммерчески доступны и обычно представляют собой 
водный раствор смеси аминокислот. При определении аминокислотного состава 
наряду с испытуемым образцом анализируются стандартные образцы белков или 
пептидов, которые используются в качестве контроля для подтверждения полноты 
всего процесса. Для этой цели в качестве стандартного образца белка используют 
высокоочищенный бычий сывороточный альбумин. 
КАЛИБРОВКА ПРИБОРА 
кАЛИБРОВКА ПРИБОРА для аминокислотного анализа обычно включает 
анализ стандартного образца аминокислот, состоящего из смеси аминокислот, 
при разных концентрациях для определения величины сигнала и рабочего 
диапазона концентраций для каждой аминокислоты. Концентрация каждой 
аминокислоты в стандартном образце известна. В процессе калибровки при 
выполнении аминокислотного анализа стандартный образец разводят до 
различных концентраций анализируемого вещества в пределах предполагаемой 
области линейности согласно используемой аналитической методике. Затем 
анализируют растворы с различными концентрациями анализируемого вещества. 
По оси ординат наносят площади пиков каждой аминокислоты, а по оси абсцисс — 
соответствующие известные концентрации каждой аминокислоты с учетом 
разведений. Эти результаты позволяют определить область концентраций 
аминокислот, в которой зависимость площади пика данной аминокислоты от ее 
концентрации является линейной функцией. Важно, чтобы образцы для 
аминокислотного 
анализа 
были 
приготовлены 
таким 
образом, 
чтобы 
концентрации аминокислот в этих образцах находились в пределах аналитических 
границ (т.е. в рабочей линейной области) используемой методики с целью 
получения точных и воспроизводимых результатов.

---

Для 
определения 
коэффициента 
сигнала 
каждой 
аминокислоты 
анализируют от 4 до 6 концентраций стандартного образца. Коэффициент сигнала 
рассчитывается как среднее значение площади или высоты пика на 1 нмоль (10
-9
моль) аминокислоты, присутствующей в стандартном образце. Коэффициенты 
сигнала каждой аминокислоты используют для расчета концентрации каждой 
аминокислоты, представленной в испытуемом образце. Количество вещества 
(нмоль) анализируемой аминокислоты рассчитывают путем деления площади 
пика, соответствующего данной аминокислоте, на коэффициент сигнала этой 
аминокислоты. Для рутинного анализа может быть достаточно калибровки по 
одной точке; при этом калибровка по коэффициентам сигнала каждой 
аминокислоты должна часто обновляться и проверятся для контроля 
достоверности. 
ПОВТОРЯЕМОСТЬ 
Полный аминокислотный анализ требует от аналитической лаборатории 
контроля повторяемости результатов количественного определения. Во время 
хроматографического разделения аминокислот или их производных на 
хроматограмме наблюдается множество пиков, относящихся к аминокислотам. 
Большое количество пиков делает необходимым наличие программного 
обеспечения, способного неоднократно идентифицировать пики, основываясь на 
времени удерживания, и интегрировать площади пиков для количественных 
расчетов. Типичная оценка повторяемости включает приготовление стандартного 
раствора аминокислот и анализ многократных повторных вводов пробы 
(например, 6 или более повторных вводов) одного и того же стандартного 
раствора. Определяют относительное стандартное отклонение (RSD) значений 
времени удерживания и интегрированной площади пика каждой аминокислоты. 
Оценку повторяемости дополняют включением многократных количественных 
определений, проводимых в течение нескольких дней разными аналитиками. 
Многократные 
количественные 
определения 
включают 
приготовление 
стандартных разведений из исходных материалов для определения различий 
результатов, возникающих из-за манипуляций с образцом. При оценке 
повторяемости часто проводят аминокислотный анализ состава стандартного 
образца белка (например, бычий сывороточный альбумин). На основе оценки 
относительных стандартных отклонений (RSD) лаборатория рассчитывает 
аналитические пределы для подтверждения того, что анализы в данной 
лаборатории проведены надлежащим образом. Для гарантирования наилучших 
результатов желательно установить наименьшие практические пределы 
отклонений. Факторы, на которые следует обратить внимание для уменьшения 
отклонений в результатах аминокислотного анализа, включают приготовление 
образца, высокие фоновые спектральные помехи из-за качества реактивов и/или 
лабораторных манипуляций, работу и обслуживание приборов, анализ и 
интерпретацию данных, профессиональные качества аналитика и его состояние. 
Все параметры, о которых идет речь, должны всесторонне исследоваться в 
рамках проведение валидации. 
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА 
Точные результаты аминокислотного анализа требуют использования 
очищенных образцов белков и пептидов. Компоненты буфера (например, соли, 
мочевина, детергенты) могут повлиять на аминокислотный анализ и должны 
удаляться из образца перед анализом. В методиках с использованием 

---

постколоночной дериватизацией аминокислот, компоненты буфера обычно не 
оказывают значимого влияния по сравнению с методиками с предколоночной 
дериватизацией. Желательно ограничить число операций с образцом для 
уменьшения потенциально возможного фонового загрязнения, улучшения 
открываемости анализируемого вещества и уменьшения трудозатрат. Общие 
технические приемы, которые используются для удаления компонентов буфера из 
образцов белка, включают следующие методы: (1) введение образца белка в 
обращенно-фазовую систему ВЭЖХ, удаление белка с помощью летучего 
растворителя, содержащего достаточное количество органического компонента, и 
высушивание образца в вакуумной центрифуге; (2) диализ с летучим буферным 
раствором или водой; (3) ультрафильтрационное центрифугирование для замены 
буфера летучим буферным раствором или водой; (4) осаждение белка из 
буферного раствора с использованием органического растворителя (например, 
ацетона); (5) гель-фильтрацию. 
ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ 
Внутренний стандарт 
рекомендуется использовать для контроля 
физических и химических потерь и изменений в ходе аминокислотного анализа. 
Перед гидролизом к раствору белка может быть прибавлено точно известное 
количество внутреннего стандарта. Открываемость внутреннего стандарта 
указывает на общую открываемость аминокислот белкового раствора. Однако 
свободные аминокислоты ведут себя иначе, чем аминокислоты белка во время 
гидролиза, скорость высвобождения которых всегда разная. Поэтому 
использование внутреннего стандарта для введения поправки на потери в ходе 
гидролиза может давать недостоверные результаты, что необходимо учитывать 
при их интерпретации. Внутренние стандарты также могут быть добавлены к 
смеси аминокислот после гидролиза для введения поправки на различия во 
введениях пробы образца, на изменяющуюся стабильность реактивов и на 
отклонения скорости подвижной фазы. В идеальном случае в качестве 
внутреннего стандарта используют коммерчески доступную аминокислоту, 
которая отличается от природных аминокислот. Кроме того, внутренний стандарт 
должен быть стабильным в ходе гидролиза, его коэффициент сигнала должен 
иметь линейную зависимость от концентрации и выходить из хроматографической 
колонки со свойственным только этому стандарту временем удерживания без 
перекрывания пиков других аминокислот. Наиболее часто используемые 
стандартные образцы аминокислот включают норлейцин, нитротирозин и α-
аминомасляную кислоту. 
ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ 
Для аминокислотного анализа белков и пептидов необходимо проводить 
гидролиз. Лабораторная посуда, используемая для проведения гидролиза, 
должна быть очень чистой. Опудривающий порошок для перчаток, а также 
отпечатки пальцев на посуде, в которой проводится гидролиз, могут привести к 
загрязнению. Для очистки стеклянных пробирок для проведения гидролиза 
используют кипячение в течение 1 ч в 1 М хлороводородной кислоте или 
замачивание в концентрированной азотной кислоте или в смеси из равных 
объемов концентрированных хлороводородной и азотной кислот. Чистые 
пробирки, используемые для гидролиза, промывают водой высокоочищенной, 
затем ополаскивают метанолом для хроматографии, сушат в сушильном шкафу в 
течение ночи и хранят закрытыми вплоть до использования. Для удаления 

---

загрязнения из пробирок, которые используются для гидролиза, также можно 
использовать прокаливание чистой стеклянной посуды при температуре 500 °С в 
течение 4 ч. Допускается использование соответствующих одноразовых 
лабораторных принадлежностей.
Кислотный гидролиз является наиболее часто используемым методом для 
расщепления белка перед проведением аминокислотного анализа. Метод 
кислотного гидролиза может повлиять на отклонение результатов анализа из-за 
полного или частичного разрушения некоторых аминокислот: триптофан 
разрушается, серин и треонин частично разрушаются, метионин может 
подвергаться окислению, а цистеин обычно определяется как цистин (но 
открываемость цистина обычно низкая вследствие частичного разрушения или 
восстановления до цистеина). Применение соответствующего вакуума (менее 200 
мкм ртутного столба, или 26,7 Па) или введение инертного газа (аргона) в 
пространство реакционного сосуда может уменьшить степень окислительной 
деструкции. В пептидных связях, образованных изолейцином и валином, амидные 
группы Иле-Иле, Вал-Вал, Иле-Вал и Вал-Иле гидролизуются частично; аспарагин 
и глутамин дезамидируются с образованием соответственно аспарагиновой и 
глутаминовой кислот. Потеря триптофана, аспарагина и глутамина в ходе 
кислотного гидролиза ограничивает количественное определение до 17 
аминокислот. Некоторые из описанных ниже методов кислотного гидролиза 
используются для решения этих задач. Некоторые методы гидролиза (например, 
методы 4—11) могут приводить к превращениям в другие аминокислоты. Поэтому 
преимущества использования конкретной методики оцениваются относительно 
задач, решаемых с ее помощью, и всесторонне изучаются перед выбором 
методики, отличающейся от обычного кислотного гидролиза.
Для определения исходной концентрации аминокислот, которые частично 
разрушаются или медленно отщепляются, часто используют исследование 
гидролиза во времени (аминокислотный анализ при кислотном гидролизе в 
течение 24 ч, 48 ч и 72 ч). Путем построения графика зависимости найденной 
концентрации лабильных аминокислот (например, серина и треонина) от времени 
гидролиза и экстраполяции полученной кривой к началу координат определяют 
исходную концентрацию этих аминокислот. Концентрацию остатков аминокислот, 
которые медленно отщепляются (например, изолейцин и валин), принимают 
равной высоте плато на полученном графике зависимости концентрации остатков 
от времени гидролиза. Если гидролиз будет протекать слишком долго, 
концентрация остатков аминокислот в образце начнет уменьшаться, что 
указывает на их разрушение при данных условиях гидролиза.
Приемлемой альтернативой исследованию гидролиза во времени является 
проведение гидролиза стандарта аминокислот с известными концентрациями в 
таких же условиях, что и для испытуемого образца. Аминокислоты в свободном 
состоянии не могут в полной мере отражать скорость деструкции при 
гидролизелабильных аминокислот, входящих в состав пептидов или белков. Это 
особенно справедливо для медленно расщепляющихся пептидных связей 
(например, связи Иле-Вал). Однако данная методика позволяет аналитику учесть 
лишь некоторую часть разрушающихся аминокислот. Возможно применение 
кислотного гидролиза с использованием микроволнового излучения, который 
отличается быстротой, но требует специального оборудования, а также 
специальных мер предосторожности. Оптимальные условия гидролиза с 
использованием микроволнового излучения должны быть установлены для 
каждого отдельного белкового/протеинового образца. Микроволновый гидролиз 
обычно протекает в течение нескольких минут, но отклонение даже в одну минуту 
может привести к неудовлетворительным результатам (например, неполный 

---

гидролиз или разрушение лабильных аминокислот). Полный протеолиз с 
применением смеси протеаз может быть слишком сложным, он требует 
надлежащего контроля и обычно более подходит для пептидов, чем для белков.
Для определения оптимальных условий в ходе первоначального анализа 
белка неизвестного состава проводятся эксперименты с различными временами 
гидролиза и при разных температурных режимах.