Mikrobiologiya va immunologiya

4-Mavzu. SEROLOGIK TEKSHIRISHNING IMMUNOFERMENT USULI
(ELISA TEST)


Immunoferment usul mikroorganizmlar va antitelolarni aniqlash hamda qiyoslash uchun qo'llanadi. Immunoferment usulining ikki turi farqlanadi: gomogen va geterogen.
Geterogen usul (immunosorbentli ELISA test) va suvda erimaydigan polimerazali materiallar yuzasida adsorbirlangan enzimi nishonlangan antitelolar (yoki antigenlar) reaksiyasi (ENAR).
Gomogen immunoferment usulida qattiq (zich) faza ishlatilmaydi; asosan past molekulali antigenlarni (gormonlar, dorivor preparatlarni) aniqlash uchun ishlatiladi.
Zich fazali immunofermentli usul komponentlari:
l. Maxsus immunoglobulinlar (immun zardobdan ammoniy sulfat bilan cho'ktirib, keyin tozalab olinadi).
2. Turga qarshi globulinlar (giperimmun zardobdan ammoniy sulfat bilan cho'ktirib, keyin tozalab olinadi).
3. Oqsil A (tilla rang stafilokokkdan olinadi) yoki ho'kiz zardobi albumini.
4. Antigen (zararlangan hayvonlar organlaridan tayyorlanadi). Oldindan ma'lum bo'lgan musbat va manfiy antigenlar.
5. Peroksidaza fermenti (xrendan olinadi).
6. Kon'yugatlar (periodatli oksidlanish usulida antitela yoki antigen bilan bog'langan peroksidaza).
7. Substratli aralashma (5-aminosalisil kislota va vodorod peroksidi yoki ortofenilyndiamin va vodorod perikisi).
8. Detergent (sirtga faol moddalar: tvin-20, -80, triton X-300, sorbital S-20).
9. Immunologik planshet (shaffof polistiroldan tayyorlangan).
10. Shpris - dozator (peaksiya ingridientlarini quyish uchun).
11. Reaksiyani qo'yishning bevosita va bilvosita usullari mavjud.
Amaliyotda asosan bilvosita usul qo'llanadi.


Antigenni immunoferment usulida aniqlash.

Reaksiyani qo'yishdan avval, liofillangan komponentlar yorlig'ida ko'rsatilgan hajmda 0,01 M fosfatli bufer eritma yoki distillangan suv bilan eritiladi va ishchi eritma hajmiga yetkaziladi. Planshet o'yiqchalariga bosqichma bosqich solinadigan komponentlar o'zaro teng hajmda bo'lib, 0,1 ml ni tashkil etadi.

Reaksiya bosqichlari:
l.Planshetni sensibillash. Planshet o'yiqchalariga maxsus antitelalar (immunoglobulinlar) yorlig'ida ko'rsatilgan ishchi eritmasi quyiladi. Planshet antitelalar bilan uch soat termostatda 37°C da yoki 18 soat 4°C daqo'yiladi. Keyin planshetlartvinli fosfat buferi eritmasi bilan 3-4 marta yuviladi. Eritmaning qoldiqlari filtr qog'ozga planshetni bir necha bor qoqib olinadi.
2.Antigen quyish. Maxsus antitelalar bilan sensibillangan planshet o'yiqchalariga nazoratli musbat va manfiy antigenlar hamda 1:10 dan 1:1280 nisbatgacha suyultirilgan sinovli namunani quyib, termostatda 37°C da 1 soat undiriladi. Inkubasiya muddati o'tishi bilan planshet o'yiqchalaridagi antitela bilan bog'lanmay qolgan antigenlarni uch marta yuvib, filtr qog'ozda quritiladi.
3.Antigen + antitelo kompleksini aniolash uchun suyultirmalarga turga qarshi perosidazali kon'yugatni quyish. Kon'yugat quyib chiqilgach planshetalar termostatga 37°C da 1 soat qo'yiladi. Keyin o'yiqchalarni uch marta tvinli fosfatli bufer bilan yuvib quritiladi.
4.Substratli aralashmani quyish. Reaksiya namoyon bo'lishi uchun planshet o'yiqchalariga substrat eritmasi (peroksidaza indikatori) - ortofenildiamin quyiladi. Eritmaga antigen + antitelo - kon'yugat kompleksini aniqlash uchun 3% li vodorod peroksid eritmasi qo'shiladi. Planshetlani yopib qorong'i joyda uy haroratida 15-30 daqiqa qoldiriladi.
5. Reaksiya ko'rish orqali yoki spektrofotometrik usulda hisobga olinadi. Reaksiya ko'rish orqali baholanganda kesishmalar soni bilan ifodalanadi :
++++ - intensiv bo'yalgan ; +++ - sabzi rang bo'yalgan ; ++ - och sabzi rang bo'yalgan; + - sariq rang bo'yalgan.
Ikki va undan ortiq nishonga baholangan namuna musbat hisoblanadi. Maxsus antitelo bilan reaksiyada eng yuqori suyultirishda planshetaning nazoratli o'yiqlari rangidan intensivligi yuqori bo'lib, och sabzi rang bo'yalsa (++), antigen titri hisoblanadi. Reaksiya natijalarini spektrofotometrik hisobga olishda maxsuslik koeffisienti hisoblanadi. U o'yiqchalardagi reaksiya mahsulotlarining nazoratli musbat antigen (OZ1) optik zichligini (OZ) o'yiqchalardagi substratli aralashmani nazoratli manfiy antigenli (OZ2) optic zichligi nisbatiga teng.
Maxsuslik koeffisienti 2, 1 dan kam bo'lmasa peaksiya musbat, 2,1 dan kam bo'lsa manfiy hisoblanadi.
Antitelaiarni aniqlash (yoki titrlash) uchun immunofermentli usulni qo'yish texnikasi mikrob antigenini aniqlash va qiyoslash singari bajariladi, farqi shundaki, material sifatida tekshiriladigan qon zardobi ishlatiladi.