276
организма в целом. Известно, что эти органоиды кроме основных своих функций - обеспечение
клетки
энергией, отвечают также за устойчивость организма к различным стрессовым факторам.
У некоторых организмов найдена цитоплазматическая ДНК, структурно ассоциированная с
митохондриями, но отличающаяся от собственной ДНК этих органелл. В нём может находиться до 30 %
всей ДНК клетки или даже больше, чем в самом ядре. Цитоплазматические ДНК, совсем не связанные с
митохондриями, обнаружены у многих эукариот: животных, дрозофилы, высших растений. В цитоплазме
клеток позвоночных найдены кольцевые, сверхспирализованные,
либо линейные ДНК, напоминающие
плазмиды бактерий. Предполагают, что они имеют ядерное происхождение, но несут локусы ori — точки
инициации репликации и поэтому способны к внехромосомному размножению и наследованию. Роль этих
плазмидоподобных структур в организмах эукариот не ясна, однако у кукурузы с ними связывают
феномен цитоплазматически наследуемой мужской стерильности.
Современная теория и практика защиты растений от болезней должны основываться на глубоких
молекулярно-генетических знаниях. Только на основе этих знаний возможно
создание эффективных
технологий предупреждения развития болезни у пораженных растений предупреждение развития болезни
у зараженного растения будет технологией «хай-тек» 21 века [1 ].
Открываются новые возможности управления устойчивостью растений посредством
практического использования комбинированных плазмид для трансформации их в геном растений.
Большие успехи достигнуты в таких направлениях, как физико-химический и структурный анализ состава
плазмидных ДНК, выявление и изучение пластидных мутаций, генетический и биохимический анализ
природных
различий, генетическое и физическое картирование и выявление кодирующих фрагментов.
Плазмидоподобные ДНК привлекают внимание исследователей как потенциальные векторы для
генетической инженерии растений.
Методы
Выделение митохондрий из корешков двухдневных этиолированных проростков
выполнили по методу Т.Юсупова и др. [2]. Корешки измельчали в буфере для гомогенации (буфер А: 0,3
М сахароза, 50Мм трис-HCl, рН 7,8, 3мМ ЭДТА,0,1% БСА, 0,1 ПВП 5000 мкг/мл гепарин) в течении 30
сек в высокоскоростном гомогенизаторе МР (Польша). Отфильтрованный гомогенат (3000 обр./мин 10
мин) для освобождения от клеточных обломок, затем митохондрии осаждаются центрифугированием в
режиме 12000 обр./мин 45 мин. Органеллы суспендируют в исходном буфере А, наслаивают на
ступенчатый градиент (0,6 М : 0,9 М : 1,6 М) центрифугируют при 22000 обр./мин 60 рН 7,8мин. Слой
между 1,6 М и 0,9 М сахарозой отбирают, ресуспензируют в буфере 0,05Мм трис-HCl, рН 8,0, 0,02 М
ЭДТА, 2% саркозил нартия, 300 мкг/мл протеиназы К и выдерживали 1 час при 37
0
С.
Лизат дважды
депротеинизировали равным объемом насыщенного смесью: фенол - хлороформ (50+50), и один раз –
смесью: хлороформ + изоамиловый спирт (24:1). Водную фазу отбирали и осаждали 2,5 объема
охлажденного этанола и 3 М ацетат натрия, рН 5,8 до конечной концентрации 0,3 М. осадок должен
растворяться в ТЕ буфере (10 мМ трис НСl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА). Добавив к раствору хлористый цезий и
краситель центрифугируют в бакет-роторе С–45 ультрацентрифуги К-32 при режиме 37 000 обр./мин в
течении 48 часов при 18
0
С , полученную таким методом ДНК экстрагировали и отмывали от красителя
депротеинизацией с последующим осаждением.
Полученные ДНК обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами в соответствующих условиях.
Препараты ДНК, продукты реакции с рестрикционными эндонуклеазами анализировали с помощью
электрофореза в агарозном геле разной концентрации в горизонтальных пластинках.
К началу работ по изучению митохондриального генома хлопчатника
редко можно было
встретить сообщения о плазмидоподобных ДНК (ппДНК). У высших растений существование таких
структур ставилось под сомнение. Однако, при выделении препарата ДНК по выше рекомендованной
методике вместе с митохондриальной ДНК (мтДНК) хлопчатника обнаружены были и быстро
мигрирующие фракции. При сравнении электрофоретической подвижности
этих ДНК с линейными
фрагментами известной длины установили размер ппДНК, равный примерно 6,5 и 2,3 т.п.н. для pGHm1 и
pGHm2, pGВm1 и pGВm2 (p – plasmide, G –
Gossypium, H –
hirsutum, B –
barbadense, M - mitochondrial). В
научной литературе опубликовано, что ппДНК обнаружены у кукурузы, сорго, сахарной свеклы, табака и
пшеницы. Детально изучены ппДНК кукурзы (s
-1
и s
-2
).
Структурные компоненты генома такого характера, в частности ппДНК, очень важны в свете их
практического использования в новых технологиях для создания новых сортов растений. В связи с этим
была поставлена цель: изучение первичной структуры ппДНК pGHm2.
Как выявлено в процессе исследований pGHm2 имела наименьший размер среди других ппДНК –
2,215 т.п.н., но по числу копий на митохондриальный геном (мт-геном) - около 4. Это количество ближе к
максимальному числу копий на мт-геном. Для клонирования ппДНК pGHm2 обработали рестриктазой Sal
1 и получили линейный фрагмент. Изучаемая нами ппДНК была подвержена обработке еще девяти
эндонуклеаз и выявлены сайты рестриции, характерные для них.
В составе ппДНК pGHm2 входят уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз Асс I, Bss GII,
EcoR I, Kpn I, Pvu I и XbaI (табл.1).
