Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Молекулярно-генетические исследования.
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) был разработана в 1983 году Керри Мюлли сыном, он был удостоен в 1993 году Нобелевской премии по химии.Открытие метода ПЦР было большим успехом в области молекулярной генетики, прежде всего, дало возможность обнаружить геномы целого ряда микроорганизмов. ПЦР анализ дал возможность диагностировать многие инфекционные заболевания, а также трудно культивируемые агенты, генотипирование возбудителя, оценивать их вирулентность, определить устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, перинатальную диагностику, а также выявлять загрезнённость препаратов крови.
Фермент ДНК-полимеразы бактерий, которые живут в гейзерах, дал уникальную возможность для изучения ПЦР. Эти ферменты очень термостойкие, оптимум 72 °С.
В настоящее время детекция результатов ПЦР -диагностики проводится в следующих системах:
- Гель-электрофорез;
- ГТФ –гибридизационно-ферментный анализ;
- FLASH – флюоресцентная детекция результатов;
- ПЦР флюоресцентная детекция во время ПЦР диагностики (в реальном времени).
Метод ПЦР имеет следующие преимущества:
1. Доказательство заболевания с помощью выявления конкретных частей ДНК / РНК возбудителя;
2. Высокая специфичность связана с определением конкретного фрагмента ДНК возбудителя в исследуемом материале;
3. Высокая чувствительность выявления вирусов, даже в пределах одной клетки;
4. Универсальность. Могут быть иследованы различные биологические материалы (слизь, моча, мокрота, эпителиальные клетки, кровь, сыворотка);
5. Быстрота получения результатов анализа;
6. Можно диагностировать не только острые, но даже инфекции в латентных формах.
Ограничения использования метода ПЦР:
- При подготовке опытного материала и/или биологического материала, полученного экстракцией, при смешивании реакционной смеси , существует возможность контаминации, что может дать ложноположительные результаты;
- большое значение имеет контаминация с продуктами амплификации, т.к. вследствие реакции накапливаются амплификоны в большом количестве.

Факторы, влияющие на результаты ПЦР:

1. Взятие биологического материала, хранение, транспортировка и обработка;
2. Некачественное разделение нуклеиновых кислот;
3. Качество функции оборудования (в первую очередь, амплификатора).
Для ПЦР-диагностики биологический материал забирается в стерильную одноразовую пластиковую пробирку. Необходимо проводить экстракцию нуклеиновых кислот и ПЦР-диагностику строго в соответствии с инструкцией, которая прилагается к диагностическому набору. Перед ПЦР-диагностикой обрабатывается биологический материал и отделяется нуклеиновая кислота.
Технология постановки метода ПЦР-
1. Утренняя цельная кровь, плазма крови, сыворотка, цереброспинальная жидкость берётся в соотношении 1:20 в пробирку с 6% -ным раствором ЭДТА. Пробирку с периферической кровью, которая герметично закрыта, перемешивают переворачиванием. Чтобы отделить плазму пробирку с кровью центрифугируют в течение 20 минут при обороте 1600. Сыворотку получают стандартным методом. Цереброспинальная жидкость не проходит предварительной обработки.
2. Внутренние органы домашних животных, а также секционные материалы гомогенизируются в фарфоровой посуде, а затем готовят из них раствор суспензии растворяя в стерильном физ.растворе или 10% -ном фосфатном буфере.
3. Перед приготовлении суспензию из мух и комаров сначала определяется их тип , затем из "пакета" (не более 50) гомогенизируют в физ. растворе или буфере, центрифугируют при обороте 10000 и 100 мкл надосадочной жидкости берут на исследование.
4. Для приготовления суспензии из клешей, сначала определяется вид, и затем, как указано выше, готовится суспензия для исследования.
Выделение ДНК / РНК включают в себя следующее:
- биологические материалы;
- лизис клеточных и вирусных оболочек
- деструкция нуклеопротеидного комплекса;
- инактивация и удаление экзо- и –эндогенных нуклеаз;
- инактивация и удаление ингибиторов ПЦР.
Последний продукт экстракции – чистый препараты ДНК и РНК.
Полимеразная цепная реакция – синтез копий фрагментов отмеченной части ДНК в пробирке. Этот метод основан на естественной фермента репликации ДНК-полимеразы.
Репликация ДНК состоит из нескольких этапов:
1. денатурация ДНК (распад две спирали ДНК);
2. появления двух коротких цепочек ДНК (необходим для инициации синтеза ДНК);
3. Синтез новой цепи ДНК (завершение комплементарного строения двух нитей ДНК).
Синтез комплементарной цепи начинается из стартовых блоков – двух коротких двухнитевых частей. Этот процесс синтеза ДНК конкретного участка происходит только в этой части, а не вдоль цепи ДНК. В синтезе компонентов ДНК участвуют два олигонуклеотида, известные как праймеры. Праймеры находятся с левой и правой стороны специфических фрагментов ДНК и ограничивают синтез комплементарных последовательностей ДНК между ними. Для получения нужного количества ДНК цикл амплификации повторяется (от 20 до 40).
Для проведения амплификации необходимы следующие комплементы:
1. Начальная молекула ДНК, содержащаяся в специфическом фрагменте (матрица).
2. Праймеры, последовательно комплементарные ДНК, на границе исследуемого специфического участка (синтетические олигонуклеотиды 20 - 30 пар нуклеотидов).
3. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (материал для синтеза нового комплементарного фрагмента ДНК)
4. Фермент Taq-полимераза (термоустойчивая ДНК-полимераза, катализирующая соединение увеличивающихся праймеров из цепи ДНК).
5. Буферный раствор (содержащий Mg 2 + ион реакционная среда, которая необходима для поддержания активности ферментов).
Каждый цикл амплификации включает в себя 5 этапа, проходящие при различных температурах
1 этап - денатурации ДНК (разрыв двух спиралей).протекает при 93° - 95°С в течение 30 - 40 секунд.
2 этап – соединения праймеров (смягчение). Протекает в специфических частях нити ДНК – комплементарный синтез нитей ДНК. Для смягчения каждой пары праймера существует своя температура, обычно она в пределах 50-65 ° С в течение 20-60 секунд.
3 - этап – завершение синтеза цепи ДНК. Синтез комплементарной цепи ДНК завершается от 5 до 3 последовательности конечной цепи. Для синтеза новой ДНК материалом служит дезоксинуклеотидтрифосфаты. Синтез ДНК катализируется термостабильным ферментом (Taq-полимераза) и проходит при температуре 70-72 ° С. Синтез происходит в течения - 20-40 секунд.Вновь синтезированная цепь ДНК первого цикла амплификации служит в качестве матрицы для следующего цикла, так появляется специфические фрагменты ДНК (ампликоны). Амплификоны служат матрицей для последующих синтезов. Таким образом, по формуле 2n происходит накопление ампликонов, где n число циклов амплификации. Следовательно, если в исходном растворе была одна молекула ДНК, то после 30 -40 циклов их количество увеличилось до 108 молекулы ампликонов. Это достаточное количество для детекции.

Рисунок 65. Схема постановки ПЦР. дДНК- дезоксинуклеотидтрифосфат
Исследование наличия РНК ПЦРом в биологическом материале состоит из следующих этапов:
- экстракция РНК из исследуемых образцов;
- проведение обратной транскрипции и амплификации в режиме «реального времени» с флюоресцентной детекции;
- Анализ и интерпретация полученных результатов.
Для анализа результатов каждого этапа ПЦР-анализа, необходимо отделить различные этапы территориально, они размещаются в отдельных комнатах. Лабораторная диагностики проводится поочередно (в последовательности) и комнаты должны сообщаться друг с другом.
●Комната приёма, регистрации и первичной обработки биологических материалов.
●В комнате предыдущей комнате ПЦР-диагностике проводится экстракция ДНК / РНК, подготовка реакционной смеси для ПЦР (это происходит в различных ламинарных боксах).
● Комната для ПЦР, где проводится детекция продукции. В этой комнате разрешено применять и другие методы диагностики инфекций.
Когда используется классический способ ПЦР (гель-электрофорез) требуются дополнительные комнаты.
Обработка биологических материалов и приготовление реакционной смеси проводится в комнате с ультрафиолетовыми лампами и ламинарным столом.
В комнате ПЦР – диагностики должны быть свои наборы лабораторных реагентов, автоматические пипетки (дозаторы), пластиковые и стеклянные посуды, лабораторное оборудование, халаты и перчатки.
В каждом из них должны быть отметки для того, чтобы не выносить в другую комнату.
В лаборатории могут работать специалисты с высшим или средним специальным образованием, обученные в специальных курсах диагностики и прошедшие обучение по биологической безопасности.