Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Метод иммуноферментного анализа отличается применением дополнительных реагентов в реакции АГ и АТ, меченных ферментов (пероксидаза, щелочная фосфатаза). После образования иммунного комплекса, в систему добавляется субстракт, обогащенный ферментами, при этом среда становится желтоватой (при участии пероксидазы) или желтовато-зеленой (при участии фосфатазы). В последние года разрабатываются различные модификации ИФА. На практике клинической иммунологии в основном применяют "сендвич" твердофазный вариант ИФА. Разработаны прямые и непрямые методы ИФА.

Рисунок 60. Реакция прямой и непрямой ИФА.

Прямой метод ИФА
На антиген, адсорбированный (на полистероловый планшет) на твердый субстрат добавляем исследуемую смесь сыворотки. Если иследуемое АТ содержится в сыворотке крови, то он специфически связывается с АГ.
В следующем этапе многократным промыванием удаляются несвязанные антитела. В третьем этапе к соединению антигена и антитела добавляют меченную ферментную антиглобулиновую (коньюгат) сыворотку крови. На четвертом этапе определяется маркер фермента, связанного с антителами.

Непрямой метод ИФА.На твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления не связавшихся компонентов, добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом к IgG. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов.

1.В иммунносорбентные лакуны добавляем 0,25 мкл рабочего конъюгата ВИЧ-1. Затем в лакуны планшета добавляем 0,75 мкл контрольного образца (К+, К-). Применение конрольного образца зависит от количества стрипов, следовательно смотри по схеме:

1. 
   1 стрип -1лакунаК+, 2 лакунаК-;
   
2. 
   2 стрип- 2лакунаК+, 2 члакунаК-;
   
3. 
   3 и более -2ч лакуна К+. 3 лакунаК-.
   

Например, если в ИФА ставят 2 стрипа, то при помощи микродозатора капают контрольные образцы в лакуны стрипов А-1 ва А-2 - 0,75 мкл К+, и в 2 лакуны В-1 ва В-2 по 0,75 мклК-. В остальные лакуны капают по 0,75 мкл образца исследуемой сыворотки крови. Ингредиенты хорошо перемешиваются в лакунах. Затем закрывают крышку планшета и оставляют при температуре 37º С на 60 минут.
2. Ингредиенты в планшете переносятся в сосуд с жидкостью с помощью приспособления вошера, планшет 4 раза промывают рабочим раствором. Каждай раз придерживают в моющем растворе по 40 сек и помещают в дез раствор.
3.В каждые лакуны стрипа помещают 100 мкл СС (смесь субстрата, буферный раствор). Закрывают крышку планшета при температуре 37º С на 30 мин.
4. Ингрдиенты из планшета при помоши вошера (прибор для мытья планшетов) переносятся в дезраствор, планшет промывается 4 раза
5. В каждой лакуне стрипа помешается по 100 мкл СС (смесь субстрата, буферный раствор.) Крышка платшета закрывается и планшет помещается в темное место на 25-30 минут при температуре 20-24С^о.
6. Для остановки реакции в лакуну планшета добавлается 100 мкл стоп реагента и результаты расматривается через 1-2 минуты.