Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №16
«ИММУНОБЛОТИНГ И ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ».
Цель лабораторной работы
- Знакомство с современными методами диагностики – применение реакций ИБ и ПЦР в практическом здравоохранении.


Задачи педагога:
- Ознакомление студентов схемой постановки реакции иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции.
- Объяснить значения и механизмиммуноблотинга и полимеразной цепной реакции.
Результаты работы
Студент должен знать:

• 
  Схему постановки реакции иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции.
  
• 
  Значение и механизм реакции иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции
  

Студент должен уметь:

• 
  Разбираться в последовательности проведения иммуноблотинга.
  
• 
  Разбираться в последовательности проведения полимеразной цепной реакции.
  

Теоретическая часть
Реакция иммуноблотинга. Иммуноблоттинг (анг. Blot - пятно) - это высокоспецифичный и высокочувствительный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов (ИФА). Основана на использование сыворотки (или АГ) для определения совместимости антигена или антитела. Используется как дополнительный эксперт метод.
Для определения антител используется гель – электрофорез со специальными белками на нитроцеллюлозной мембране. Если имеется соответствующие антитела, они располагаются в стрипе в виде чёрных полосок. Преимущество этого метода точность диагностики.
В качестве материала для исследования можно использовать сыворотку крови или плазму человека. В одной полосе для проверки должна быть 1,5-2 мл крови и 15-25 мкл сыворотки. Не возможно сохранить цельную кровь, а отделенная сыворотка хранится в холодильнике в течение нескольких дней.



Рисунок 61. Механизм получения стрипов с помощю иммуноферментного анализа.
Использование иммуноблоттинга при любых реакциях зависит от инструкций и рекомендаций производителя.
Есть два типа пакетов: вестерн-блот и лайн-блот.
Вестерн-блот: В тестовом стрипе нативные антигены инфекционных агентов будут отделены на электрофоретическом мембране и устанавливаются в зависимости от молекулярной массы антигена.

Рисунок 62. Вид комплекса вестерн-блоттинга

Вставляются на мембрану также 1 - 2 полоски (вестерн –лайн-блот) с клинически значимыми антигенами. Этот метод является подтверждающий. Он исключает все остальные ложноположительные ответы.

Лайн-блот: В этом случае на тестовый стрип - мембрану ставятся только клинически значимые антигены (нативный, синтетический или рекомбинантный). Такой подход даёт возможность дифференциации нескольких инфекций в одном тест стрипе (рисунок 2).



Рисунок 63. Лайн-блот. Для диагностики TORCH-инфекций.

Этот способ даёт возможность выявления специфических антител против антигенов, или оценить важность и исключить перекрестные реакции антигенов. Это показывает различие иммуноблотинга и ИПБ, в котором может быть использованы специфические антигены, антигенные детерминанты, а также другие возбудители, дающие перекрестные реакции в различных комбинациях.

Иммуноблот применяется для качественного определения в сыворотке и плазме больного IgM-антител, IgG-антител против гепатита C, TORCH-инфекции, вирусной инфекции Эпштейн - Барр, IgG антител против ВИЧ и других инфекций.
Интерпретация результатов, полученных с помощью иммуноблотинга, зависит от комплекса реагентов и от вида инфекции.
Иммуноблотинг проводится утвержденными методами иммуноблотинг- диагностики и правилами биобезопасности специально обученными специалистами.

64.Сероконверсия на вестерн-блоте ВИЧ-1 с одним реагентом.
Техника проведения метода иммуноблотинга:
- Берется стрип (лента), нагруженный специфическими антигенами;
- Капается исследуемая сыворотка крови на полоску стрипа и инкубируется (чтобы АТ сыворотки связались с АГ на полоске);
- Стрип промывается в буферном растворе, чтобы удалить не соединившиеся АТ;
- После промываниия в стрип добавляется меченная антиглобулиновая сыворотка, которая образует ковалентные связи с АТ;
- Стрип промывается второй раз для удаления остаточных анти глобулинов из стрипа.
- Антиглобулиновые АТ меченные, поэтому если реакция положительная, то в стрипе образуется пятна, если отрицательная – их нет.