Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Методы индикации вирусов. Введение клеточных культур в практику вирусологии привело к возможности выделения и идентификации многих вирусов и раннее не известные болезни. На сегодняшний день есть возможность выбора чувствительных клеточных культур для каждого вида вирусов.
При заражение клеточных культур с материалами, содержащие вирусы, наблюдаются изменения в виде включений или гибели клеток в результате размножения вирусов. Это свойство вирусов рассматривается как ЦПД (цито-патогенное действие) , т.е. изменение морфологии клеток, даже их гибель. Их распознают (индикация) по следующим феноменам.
1. ЦПД вируса к клетке.
2. Образование вирусных включений в клетке
3. Образование бляшек в культурах клеток
4. Реакция гемадсорбции.
5. Реакции гемагглютинации
6. Цветная реакция
7. Интерференция
Приведенные выше методы имеют важное значение в индикации вирусов в вирусологической практике. Реакция гемагглютинации широко применяется при идентификации вируса гриппа и при определении его типа.
Реакция гемагглютинации. Это реакция применяется для индикации вирусов в жидкостях клеточных культур или в амниотических жидкостях куриного эмбриона. Реакция гемагглютинации проявляется у вирусов, которые имеют гемагглютинин в составе суперкапсида (грипп, парагрипп), то есть если добавить эритроциты кур, гуся, морских свинок в клеточные культуры, вирусы склеивают эритроциты друг к другу. В этом методе титр вирусов в жидкостях можно определить степенью разбавленности. Широко применяется в индикации вирусов.
Постановка реакции гемагглютинации (РГА). Эту реакцию можно ставить на сетке как ориентировочную и в лунках пластин (можно в пробирках).
При постановке ориентировочной реакции на предметное стекло наносят 1%-ной взвеси эритроцитов, чувствительных к исследуемому вирусу, и каплю исследуемого и материала, перемешивают. Если результат положительный, то через 2-3 минуты наблюдают появление агглютининов.
При постановке развернутого варианта готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят0,5 мл 1%-ной взвеси отмытых эритроцитов.
Для контроля спонтанной агглютинации 0,5 мл взвеси эритроцитов в пробирку с 0,5 мл физиологического раствора , не содержащего вируса. Материал ставят в термостат при 37º С, 22º С или 4ºС в зависимости от свойств изучаемого вируса. Результат реакции проверяется после 40 минут т.е. осаждение эритроцитов. Если реакция положительная на дне пробирки обнаруживается тонкая пленка из прилипших эритроцитов в форме зонтика. Результаты реакции определяются с четырьмя положительными знаками. ++++ на дне пробирки ясное появление пленки в форме зонтика; +++ -бывает промежуточные места с разрывом в пленке; ++-- за счет уменьшении вирусов зонтик из эритроцитов не полный, края пленки разглаживается; +--- осаждение эритроцитов в центре, а по окружности их мало; ---- края осадков эритроцитов явно выделяются пуговкой, не отличается от контроля (эритроциты принимает форму пуговки). Если реакция гемагглютинации проявляется в испытуемых пробирках, но не проявляется в контрольных, это показывает наличие вируса в исследуемой жидкости.
При индикации вирусов определение титра вирусов в исследуемой жидкости имеет важное диагностическое значения. При максимальном разбавление вируссодержавшего материала количество вирусов, проявляющих инфекционную активность называется титром вируса. Титр был принят как единица измерения количества вируса в материале, то есть в этом титре 50 % вирусов проявляют ЦПД по отношению к заражаемой культуре. Титром вируса РГА называется реакция, показывающая агглютинацию эритроцитов не менее ++. Определения титра вирусов имеет важное значение при разработке рабочей заражающей дозы вирусов и в дальнейшем их идентификацию.
Таблица №1