Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Определение иммунокомпетентных клеток моноклональными антителами прямым методом РОК.
Сущность метода заключается в том, что если имеются у лимфоцитов рецепторы к моноклональным антителам, то к ним прикрепляются эритроциты и образуют РОК. Этот метод прост в исполнении и специфичен, в связи с чем широко применяется в клинической лабораторной практике. На сегодняшний день чаще других моноклональными антителами определяются: СД3- Т-лимфоциты, СД4- хелпер/индукторы, СД8- Т-супрессор/цитотоксические лимфоциты, СД19- В-лимфоциты, СД16- естесственные киллеры.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов с моноклональными антителами для выявления иммунокомпетентных клеток
Эритроцитарные диагностикумы для Т-лимфоцитов (СД3) готовятся следующим образом. К 1% эритроцитам человека 1-группы резус - отрицательный (0,1мл) добавляется 5 мкл моноклоналных антител и раствор 0,3% ного хлорида хрома 50 мкл. Полученная суспензия встряхивается 5 минут, моется в физ. растворе 3 раза в центрифугированием 1500 обор/мин. Затем суспензия инкубируется 5 мин в 1% ном растворе альбумина и отмывается двухкратно в физ.растворе при 1500 обор/мин . Рабочая концентрация эритроцитарного диагностикума доводится до 2,5% раствора. Таким же методом готовятся моноклоналные антитела к СД4-хелпер/ индукторам, СД8-Т супрессор-цитотоксическим лимфоцитам, СД19-В-лимфоцитам, СД16-естественным киллерам.
Оценка каждого лимфоцита выполняется следующим образом. Берется по 0,1 млт рабочая суспензия лимфоцитов и эритроцитарные диагностикумы с моноклоналными антителами перемешиваются и центрифугируются при 800 обор/мин, хранится в холодильнике 1 час. Суспензию слегка потряхивают для ресуспензирования и для стабилизации образовавшихся розеток капают 2,5% раствор глутарь-алдегида, из осадка готовят мазок,



Рисунок 68. Схема определения иммунокомпетентных клеток методом РОК с мАТэритрацитарным диагностикумом

фиксируется, окрашивается и подсчитывается под микроскопом количество лимфоцитов. В этом методе РОК -лимфоциты присоединяют к себе три или более эритроциты. Подсчитываются 100-200 лимфоцитов.