Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Определение В-лимфоцитов методом ЕАС-розеткообразования
Одним из простейших методов определения В-лимфоцитов в крови человека считается выявление их с помощью С3 компонента комплемента. На мембране В-лимфоцитов существует рецепторы к С3 – фракции комплементам, реакция обусловлена соединением к В- лимфоцитам этого компонента. Соединение С3-компонента комплемента к В-лимфоцитам не видимо. Чтобы обнаружить реакцию комплемент абсорбируют на эритроциты.
Приготовление эритроцитарно-антительного комплекса комплемента.
а) эритроциты человека (первая группа Rh-) моются 3 раза центрифугированием в питательной среде 199 (1000 обр/мин)
б) берется 2 мл из 2,5% ного смеси отмытых эритроцитов и добавляется разбавленная до субагглютинации кроличья сыворотки в равных количествах и ставится на 30 мин в термостат при при 37^оС.
в) к смеси добавляется 0,1 мл нормальной кроличьей сыворотки (источник комплемента) и ставится в термостат на 30 мин
г) смесь отмывается один раз с 199 питательной средой центрифугированием 800 обр/мин, 5 минут. Количество эритроцитов, присоединивших комплемент, должен достигать до 100*10⁶.
Постановка ЕАС-РОК. К 0,1 мл смеси лимфоцитов добавляются 0,1 мл 1% взвеси эритроцитов, нагруженные комплементом, и ставится в термостат на 5 минут в термостат при 37⁰C. Затем центрифигируют при 800 оборотах в течение 5 минут и ставят в холодильник при температуре 0-4ºC на 30-60 минут. Остальные этапы такие же, как и при изучении Т-лимфоцитов. У здорового человека популяции В-лимфоцитов 15-25%. В последние годы, разрабатываются специфические моноклональные антитела к антигенным детерминантам лимфоцитов. Среди них СД (кластер дифференцировки) - коллекция дифференцировочных моноклональных антител определяют специфические биомолекулы маркёров на мембране лимфоцитов. С помощью этих моноклональных антител методом цитофлюорометрии или иммуннофлюоресценции с обработанными фюорохромом антителами определяют Т и В-лимфоциты и их субпопуляции. Тем не менее, необходимо отметить, что вышеупомянутые методы требуют соответствующее лабораторное оборудование и реагенты. В последние годы учеными нашей республики налажен метод косвенной оценки с помощью моноклональных антител Т- , B-лимфоцитов и естественных киллеров.