Rasm. Begona DNK molekulasining plazmida DNK si tarkibga birikishi jarayoni. Restriktaza fermenti va ishqoriy fosfotaza bilan ishlov berilgan plazmida DNK zanjiri tegishli gen sohasiga ega bo’lgan va restriktaza bilan ishlov berilgan donor DNK si bilan aralashtiriladi. Muhitga DNK-ligaza fermenti qo’shiladi. Bu yerda to’rtta bir zanjirli uzilishlardan 2 tasi jarayonni to’liq qoniqtiradi va hosil bo’lgan konstruksiya fosfodiefir bog`lari hosil bo’lishi natijasida nisbatan barqaror holatga keladi. Gibrid DNKsi xo’jayin–hujayra tarkibiga kiritilganidan keyin replikatsiya jarayoni amalga oshishi natijasija yangi halqasimon molekulalar uzilishsiz holatda replikatsiyalanadi.
Transformatsiya va tanlanish jarayoni.Navbatdagi bosqich davomida rekombinant DNK molekulasini xo’jayin–hujayra tarkibiga kiritish jarayoni amalga oshiriladi. Bu jarayon transformatsiya deb ataladi. Bu jarayonni amalga oshirish uchun maxsus ishlab chiqilgan usullardan foydalaniladi, masalan hujayralar yuqori harorat ta`sirida ishlov berilib, muhitga kalsiy xlor (CaCl2) eritmasi qo’shiladi. Biroq, bu sharoitda tansformatsiya jarayoni samaradorligi juda yuqori qiymatlarga ega bo’lmaydi, odatda bu sharoitda har 1000 ta hujayradan 1 tasida transformatsiya jarayoni amalga oshishi kuzatiladi. Ushbu ko’rinishda, muhitdagi hujayralarning ko’pchilik qismi transformatsiyaga uchramaydi, ya`ni tarkibida rekombinant DNK molekulalariga ega bo’lmasligi qayd qilinadi. Ayrim bakteriya hujayralari tarkibida esa ishqoriy fosfotazaning defosforlovchi ta`siriga uchramagan holatda qayta tiklangan plazmida DNK zanjiri yuzaga kelishi kuzatiladi. Yuqorida ta`kidlangani kabi, tarkibida replikatsiya boshlanishini ta`minlovchi gen sohalari mavjud bo’lmagan holatdagi xromosomadan tashqarida joylashgan DNK zanjiri bakteriya hujayrasi tarkibida replikatsiyaga uchramaydi. Ushbu ko’rinishda, bakteriya hujayrasiga kirgan holatdagi DNK zanjirining barchasi xo’jayin–hujayra genomi tarkibida replikatsiyalanishi ehtimolligiga ega emas. Xo’jayin–hujayra tarkibida rekombinant DNK zanjiri shuningdek, muhitda restriktazalar ta`sirida degradatsiyaga uchrashi mumkinligi qayd qilingan. Tarkibida RecA geniga ega bo’lgan hujayralarda ekzogen DNK zanjirining rekombinatsiyasi amalga oshmaydi va tashqaridan kiritilgan DNK zanjiri gomologik rekombinatsiya jarayonida modifikatsiyalanmaydi. Shuningdek, navbatdagi bosqichda tarkibida rekombinant DNK mavjud bo’lgan xo’jayin–hujayralarni aniqlash masalasi hal qilinadi. Bunda aniqlash jarayonida qo’llaniluvchi usul muhitda hujayralar soni juda ko’p bo’lgan sharoitda nisbatan samarali va sodda bo’lishi talab qilinadi.
pBR322 vektor plazmidasidan foydalanilgan sharoitda begona DNK fragmenti asosan BamHI saytiga ulanishi kuzatilib, ushbu holatda transformatsiyaga uchragan hujayralarni aniqlash 2 ta bosqichda amalga oshiriladi. Dastlab, transformatsiya jarayoni amalga oshirilganidan keyin hujayralar tarkibida ampitsillin antibiotigi mavjud bo’lgan ozuqa muhitiga ekiladi. Bu ko’rinishdagi muhitda tarkibida faqat Amprgeni intakt holatidagi yoki pBR322 intakt plazmidalari o’sish xususiyatini namoyon qiladi. Transformatsiyaga uchramagan hujayralar esa ampitsillini antibiotigi mavjud ozuqa muhitida o’sish xususiyatiga ega emas. pBR322 vektor plazmidasi tarkibida Tetr gen sohasida joylashgan BamHI saytiga begona DNK fragmenti kelib birikishi natijasida ushbu sohada nukleotidlar ketma – ketligi boshlang`ich plazmidadagiga nisbatan keskin tarzda o’zgarishi oqibatida uning tetrasiklin antibiotigiga nisbatan chidamlilik xususiyati yo’qoladi. Ushbu ko’rinishda, tarkibida gibrid plazmidaga ega bo’lgan, ya`ni transformatsiyalangan hujayralar ampitsillin antibiotigiga nisbatan chidamlilik xususiyatini namoyon qilishi, biroq muhitda tetrasiklin antibiotigiga nisbatan chidamlilik xususiyatiga ega bo’lmasligi orqali farqlanadi. Tanlash jarayonining ikkinchi bosqichda bu ikkala variantdagi hujayralar ajratib chiqiladi. Ampitsillinli muhitda o’sgan hujayralar tetrasiklinli ozuqa muhitiga o’tkaziladi. Yuqorida ta`kidlanganimizdek, tarkibida tertrasiklin antibiotigi mavjud bo’lgan Petri chashkasidagi ozuqa muhitida o’stirilgan intakt pBR322 plazmidalari ampitsillin va tertrasiklin antibiotiklariga nisbatan chidamlilik xususiyatini namoyon qiladi. Tetrasiklinli muhitga ega ozuqada o’stirilgan pBR322 plazmidalarida sezgirlik xususiyati namoyon bo’lishi esa bu plazmidalarning gibrid ekanligidan dalolat beradi. Bunda ampitsillinli ozuqa muhitida o’stirilgan va tetrasiklinga nisbatan sezgirlik namoyon qilgan koloniyalar alohida ajratib olinib, ulardan alohida hujayraalar asosida koloniyalar hosil qilinadi. Shuningdek, tadqiqotlarning ma`lum bosqichda barcha koloniyalar birlashtirilib takroriy tekshirishlar (skirining) o’tkazilishi ham mumkin.
