Genomika asoslari

DNK sekvenirlash
DNK sekvenirlash. Biopolimerlar, nuklein kislotalarni- DNK, RNK, oqsillarni sekvenirlash, ularning nukleotid va aminikislotali ketma-ketliklarini aniqlash bo’lib, lotin tilidan sequentum- ketma ketlik ma’nosini anglatadi. Sekvenirlanish natijasida monomerlar ketma-ketliging chiziqli tuzilmasi to’g’risida matn shaklida rasmiy tavsifi hosil qilinadi. DNK sekvenirlangan qismlari odatda 100 nukleotidlar juftidan oshmaydi- next generation sequencing va Senger sekvenirlanishi bo’yicha 1000 nukleotidlar jufti hosil qilinishi mumkin. Bir-birini qoplaydigan DNK qismlari sekvenirlanishi natijasida to’liq genlar, umumiy i-RNK yoki organizmlar to’liq genomi to’g’risida ma’lumot beradigan genlar qismlari olinadi (23-rasm).

21-rasm. Radiofaol izotop bilan nishonlangan PZR mahsulotlariga ega bo’lgan gel qismlari. Radioavtograf. (Senger uslubida sekvenirlash)

Sekvenirlash uchun Edman, Senger va boshqa uslublar qo’llaniladi, odatda
hozirgi kunda genlarni sekvenirlash uchun Sengerning ddNTP- didezoksinukleoziduchfosfatlar uslubi qo’llaniladi. Sekvenirlashdan oldin DNK ning PZR-polimerazali zanjirli reaksiya uslubi yordamida taniladigan ketma-ketligi amplifikasiya qilinadi. To’liq genom sekvenirlanishi yangi avlod sekvenirlash tehnoligiyalarini next generation sequencing uslubini qo’llab amalga oshiriladi.

22-rasm.DNK sekvenirlanish uslubi.
Didezoksinukleotid yoki “zanjir uzilishi” uslubi F.Senger tomonidan 1977 yilda ishlab chiqilgan bo’lib, hozirgi kunda DNK nukleotid ketma-ketligini aniqlashda keng qo’llaniladi. Senger bo’yicha sekvenirlashda sekvenirlanayotgan zanjirning maxsus 17-20 nukleotid uzunligiga ega bo’lgan sintetik oligonukleotidning gibridizasiyasi amalga oshiriladi. Bu oligonukleotid praymer bo’lib, 3’-gidroksil guruhni matritsaga komplementar bo’lgan, zanjirning inisiasiyasini boshlaydi. Praymerli eritmalar 4 ta probirkaga joylashtiriladi, ularning har birida dATP, dCTP, dGTP, dTTP dezoksinukleotidlar bo’lib, ularning biri radioizotop bilan nishonlangan va 4 ta 2’, 3’-didezoksinukleotidlardan ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP biri bo’ladi. Didezoksinukleotid hamma pozisiyalar bo’yicha uzayib borayotgan zanjirga qo’shiladi, va uning zanjirga qo’shilish joyida zanjir sintezi to’xtaydi. Buning natijasida har 4 probirkada DNK-polimeraza ishtirokida praymer ketma-ketligiga ega bo’lgan oligonukleotidlarning har hil uzunlikdagi noyob to’plami hosil bo’ladi. Keyinchalik probirkalarga zanjirlarni ajratish uchun formamid qo’shiladi, va poliakrilamid gelida to’rt hil yo’lakchada elektroforez o’tkaziladi. Sekvenirlangan DNK segmentlarini “o’qish” maqsadida radioavtografiya o’tkaziladi. Zamonaviy uslubda didezoksinukleotidlarni to’rt hil turli tuman fluorescent bo’yoqlar bilan bo’yaladi va bitta probirkada PZR o’tkaziladi. So’ngra poliakrilamidli elektroforezda lazer nuri gelning ma’lum qismida fluorescent bo’yoqlarini qo’zg’atadi va gelda migrasiya bo’lgan nukleotidni detector aniqlaydi. Zamonaviy asboblar yordamida DNK ning kapillyar elektroforezini o’tkazishda foydalaniladi.