Biokimyodan YaB uchun baza (2022-yil) Nazariy savollar

94.Qon zardobi oqsillarini elektroforez yordamida aniqlash. Qon plazmasi oqsillari va ularning vazifalari. Oqsillarni ajratib olish va tozalash.
Oqsillarni hayvonlar to‘qimasidan, makroorganizmlardan maxsus
usullar yordamida ajratib olinadi.
1. Oqsillarni ajratib olishda gomogenizatsiya usuli.
Oqsillarni hayvonlar to‘qimasidan, makroorganizmlardan ajratib
olish uchun avvalo to‘qimalar yaxshilab maydalaniladi, ya’ni
gomogenizatsiyalanadi. Bunda hujayra strukturasi buziladi oqsillar
eritmaga o‘tadi. Gomogenizatsiya qilish uchun quyidagi usullardan
foydalaniladi:
1. Chinni hovonchada to‘qimani qum bilan ezish (maydalash).
2. Potter-Elvegay gomogenizatorida maydalash.
3. Sharsimon tegirmonchalarda maydalash.
4. Kuchli ravishda muzlatib, keyin eritish yo‘li.
5. Ultratovush ta’sirida maydalash.
6. Bosim ta’sirida (muzlatilgan to‘qimani mayda teshikli po‘lat
to‘rdan o‘tkazish).
7. Azot gazi yordamida (azot gazini bosim ostida to‘yintiriladi
keyin keskin bosim pasaytiriladi. Natijada azot hujayrani oson
parchalab oqsilni eritmaga o‘tkazadi).
Yuqoridagi usullar bilan hosil qilingan gomogenatdan oqsillarni
ajratib olish uchun ekstraksiya usulidan foydalaniladi. Olingan
gomogenatni 8-10% li tuz eritmasida eritiladi. Oqsillarni
ekstratsiyalash uchun ko‘pincha ma’lum pHga ega bo‘lgan bufer
eritmalardan, organik erituvchilardan va ionsiz detergentlardan
foydalaniladi. Bu maqsadda organik moddalardan ko‘pdan beri ishlatib
kelinadigan eritmalar – glitserinning suvdagi eritmasi, saxaroza
eritmasi, limon kislota va borat bufer aralashmalar, tris-bufer
eritmalardan foydalaniladi.
Qon zardobi oqsilini ajratish uchun etil spirti, atseton, butil spirti
ta’sirida cho‘ktiriladi. Gomogenatdan toza holda oqsillarni olish uchun
har xil detergentlar ishlatiladi. Ular oqsil-yog‘ kompleksini va oqsiloqsil bog‘larini yaxshi parchalaydi. Oqsillarni (fermentlarni)
tozalashda mitoxondriya biomembranasi bilan yoki hujayra
organoidlari bilan mustahkam birikadigan modda triton X-100, natriy
dodetsilsulfat va natriy dezoksixolat ishlatiladi. Bu detergentlar oqsiloqsil komplekslarini parchalaydi va oqsillarning to‘rtlamchi
strukturasini buzadi.
Oqsillarni fraksiyalash yo‘li bilan ajratish.
Oqsillar ekstratsiya qilingandan so‘ng ekstraktni sentrifugalash
yordamida to‘qima elementlaridan tozalaniladi va eritmaga o‘tgan
oqsillarni fraksiyalash yo‘li bilan ajratiladi. Hozirgi paytda quyidagi
usullar bilan oqsillar fraksiyalarga ajratiladi: tuzlar ta’sirida
cho‘ktirish, issiqlik ta’sirida denaturatsiyalash usuli, organik
erituvchilar yordamida cho‘ktirish, xromatografiya, gelfiltratsiya,
elektroforez, ultratsentri-fugalash usullari.
Oqsillarni tuzlar ta‘sirida cho‘ktirib ajratish.
Oqsillarni ishqoriy va ishqoriy yer metall tuzlari ta’sirida cho‘ktirib
fraksiyalanganda ular o‘z xossalarini saqlab qoladi, chunki dializ yoki
gelfiltratsiya usuli bilan oqsil cho‘kmasidan tuzlar ajratib olinsa, oqsil
eritmaga o‘tadi. Bu usul biologik faollikka ega bo‘lgan fermentlarni
ajratib olishda katta ahamiyatga egadir. Klinik laboratoriyalarda qon zardobidan globulin oqsillarini
ammoniy sulfatning yarim to‘yingan eritmasi, albumin oqsillarini
to‘yingan eritmasi yordamida ajratib olinadi. Tuzlar bilan oqsilni
cho‘ktirishda oqsilning tabiati tuzlarning konsentratsiyasi hamda
eritmani pH va temperatura ahamiyatga ega bo‘ladi.
Dializ usuli
Yuqori molekulali moddalarni past molekulali moddalardan yarim
o‘tkazgich membranalar yordamida ajratish usuliga dializ deyiladi.
Dializ usuli kolloid zarrachalarni yarim o‘tkazgich membranalardan
o‘tmasligiga asoslangan. Yarim o‘tkazgich membranalarga kollodiy,
sellofan, pergament qog‘ozlari misol bo‘ladi.
Inson va hayvon organizmida buyrakdagi Boumen – Shumlyanskiy
kapsulasining pardalari ham yarim o‘tkazuvchandir. Dializ uchun ishlatiladigan asbobni dializator deyiladi. Oddiy dializator sifatida
kollodiy va sellofan qopchasi ishlatiladi. Cho‘ktirib ajratilgan oqsil
cho‘kmasini kollodiy yoki sellofan xaltachasiga joylab, distillangan suv
solingan idishga tushiriladi. Bunda vaqt o‘tishi bilan kichik molekulali
moddalar (tuzlar) xaltacha tashqarisidagi distillangan suvga chiqadi.
Oqsil esa yarim o‘tkazuvchi parda teshikchalaridan o‘tolmaydi va
xaltacha ichida qoladi.
Oqsillar aralashmasini ion almashuvchi, adsorbsiyalovchi
xromatografiya, gelfiltratsiyalash va afin xromatografiya yordamida
ham fraksiyalarga ajratiladi.
a) Ion almashuv xromatografiyasi.
Bu usulda ikki xil ion almashtiruvchi adsorbentlar sifatida ishlatiladi.
1. Kuchli va kuchsiz asosli anion almashtiruvchilar. Bularga
polistrol va sellyuloza hosilalari kiradi.
2. Kation almashtiruvchi polistirollarga sulfat birikmalari va
karboksilmetilsellyuza kiradi.
Ion almashtiruvchi moddalarni kolonkaga (uzun shisha naycha) solib
kuchsiz kislota yoki asos bilan yuviladi. So‘ngra oqsil eritmasi
o‘tkaziladi. Bunda oqsil molekulasi anion yoki kation gruppalarga
bo‘linishi natijasida oqsillarni tuzlarning turli pHli eritmasi yordamida
ajratib olinadi. b) Adsorbsion xromotografiya.
Bu usulda adsorbent sifatida faollashtirilgan ko‘mir va alyumin
oksidi ishlatiladi. Adsorbent kolonkaga solinib, erituvchi quyiladi va
oqsil eritmasi qo‘shiladi, bunda oqsil adsorbent bilan birikadi. So‘ngra
oqsil fraksiyalari turli pH li bufer eritmalari yordamida ajratib olinadi.
Oqsillarni fraksiyalarga ajratishda taqsimlanuvchi xromatografiya
usulidan foydalaniladi. Taqsimlanish xromatografiyasi adsorbsion
xromatografiyani turi bo‘lib, adsorbent sifatida xromatografiya qog‘ozi,
kraxmal, silikagel va boshqalar ishlatiladi.
d) Gel xromatografiyasi.
Bu usulda har xil gellar ishlatiladi, masalan: dekstrandan
tayyorlangan, turli markadagi sefadekslar, dekstran – yuqori molekulali
glyukoza qoldiqlaridan tarkib topgan polimer moddadir, uni ishqoriy
muhitda epixloridgidrin bilan reaksiyaga kiritilsa, gel hosil bo‘ladi.
Poliakrilamid gelini hosil qilish uchun suvda yaxshi eriydigan monomer
akrilamid olib bu funksional reagentlar ishtirokida polimerlashtiriladi.
Oqsillarni molekulalari katta yoki kichikligiga qarab
gelxromatografiya kolonkasiga gel to‘ldirilib undan oqsillar aralashmasi
o‘tkazilsa avvalo, kichik molekulali oqsillar gel g‘ovaklari orqali, gel
zarrachasining ichiga kirib diffuziyalanadi.
Yirik molekulali oqsillar bu g‘ovakchadan o‘tolmaydi, ular
zarrachaning tashqarisida qoladi va eritma bilan kolonkadan oqib
chiqadi.
e) Afin xromatografiya.
Bu xromatografiya usulli quyidagi prinsiplarga asoslangan bo‘ladi:
ajratib olinishi lozim bo‘lgan oqsilga spetsifik bo‘lgan modda Zligandda erimaydigan M moddasiga mustahkam qilib biriktiriladi.
Shunday qilib, tayyorlangan MZ-adsorbenti xromatografiya kolonkasiga
solinadi va u orqali oqsil aralashmasi o‘tkaziladi. Bunda P oqsili spetsifik
adsorbent bilan birikadi. MZ+P=MZP. So‘ngra kolonka yaxshilab
yuviladi va birikkan P-oqsilining birikmasini dissotsiatsiya qiluvchi
eritma bilan ajratib kolonkadan chiqariladi.
Elektroforez usuli
Bu usul bo‘yicha oqsillar elektr maydonida har xil harakatlanish
tezligiga asoslanib fraksiyalarga bo‘linadi. Filtr qog‘ozida o‘tkaziladigan
elektroforez usuli yordamida inson qon zardobidagi oqsillarni 6 fraksiyaga ajratish mumkin. Qog‘ozda o‘tkaziladigan elektroforezdan
tashqari hozirgi vaqtda kraxmal geli, poliakrilamid va sellyulozada
oqsillarni elektroforez yordamida fraksiyalarga bo‘lish va ajratish
mumkin.
Filtr qog‘ozi o‘rniga yuqorida ko‘rsatilgan moddalar elektroforezda
ishlatilganda qon zardobi oqsillarini ko‘proq fraksiyalarga ajratish
mumkin. Masalan: kraxmal gelida 10 ta, poliakrilamid gelida 18 ta oqsil
fraksiyalarini olish mumkin. Elektroforez yordamida ajratilgan oqsilni
aniqlash uchun qog‘oz va gellar bromfenol yoki 10 V amid qora bo‘yog‘i
bilan va boshqa oqsil bilan rang beruvchi reaktivlar bilan ishlanadi